GB/T 16551-2020 猪瘟诊断技术

ICS11.220

B41GB

中华人民共和国国家标准

GB/T16551-2020

代替GB/T165512008

猪瘟诊断技术

Diagnostictechniquesforclassicalswinefever

2020-12-14发布2020-12-14实施

国家市场监督管理总局申＃

国家标准化管理委员会保叩

GB/T16551-2020

目次

前育…··皿

引育…………..N

1范围…………….1

2规范性引用文件…··……“………·……1

3缩略语………………“……·………1

4临床症状与病理变化………”………·……2

4.1临床症状…………”………·……2

4.2病理变化……··……”………·……2

4.3结果判定……………”…2

5样本的采集、保存、运输和处理………”…2

5.1器材”………………”2

5.2试剂…………”………·……2

5.3样品采集………·……”…·……3

5.4保存与运输……“3

5.5样本处理………”…3

6实验室病原学诊断方法…………”……….3

6.1免疫荧光抗体试验（FAT)…3

6.2免疫过氧化物酶试验CIPT)…4

6.3猪瘟病毒分离与鉴定…·……”……………5

6.4猪瘟病毒RT-nPCR检测方法”…6

6.5猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法……·……………6

7实验室抗体检测方法……………6

7.1猪瘟病毒中和试验…·……”………·……6

7.2猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法…………·……9

7.3猪瘟抗体间接ELISA检测方法…·”……9

7.4猪瘟病毒化学发光抗体检测方法…·……”………·……9

8综合判定……………·……”…………10

附录AC规范性附录）试剂配和tl……·……”…………11

附录B（规范性附录）猪瘟病毒TCID50测定……”……·………14

附录C（规范性附录）校准品的制备………”……15

I

GB/T16551-2020

前言

本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。

本标准代替GB/T16551-2008《猪瘟诊断技术讥与GB16551-2008相比，主要技术变化如下＝

一一修改了“范围”（见第1章，2008年版的第1章h

一一增加了“规范性引用文件”（见第2章〕g

一一增加了“缩略语”（见第3章）;

修改了“临床及病理学诊断”部分，并更名为“临床必状与病理变化气见第4章，2008年版的

第2章h

一一增加了“样本的采集、保存、运输和处理”部分（见第5章）;

一一修改了“病原学诊断”部分，并更名为“实验室病原学诊断方法”（见第6章，2008年版的第3章川

一一删除了“兔体交互免疫试验”部分（见2008年版的3.1);

一一修改了“免疫酶染色试验”和“直接免疫荧光抗体试验”部分，更名为“免疫荧光抗体试验

(FAT）”和“免疫过氧化物酶试验(IPT）气见6.1、6.2,2008年版的3.2、3.4);

修改了“病毒分离与鉴定试验”部分，更名为“猪瘟病毒分离与鉴定”（见6.3,2008年版的3.3);

一一删除了“猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应CRTPCR）”（见2008年版的3.5);

一一增加了“猪瘟病毒R下nPCR检测方法”和“猪瘟病毒实时荧光R二r-PCR检测方法”（见6.4、6.5);

一一修改了“血清学诊断”部分，并更名为“实验室抗体检测方法”（见第7章，2008年版的第4章）;

修改了“荧光抗体病毒中和试验”部分，并更名为“猪瘟病毒中和试验”（见7.1,2008年版的

4.1);

删除了“猪瘟单抗酶联免疫吸附试验”（见2008年版的4.2);

一一增加了“猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法川猪瘟抗体间接ELISA检测方法”和“猪瘟病毒

化学发光抗体检测方法”（见7.2、7.3、7.4）。

本标准由中华人民共和国农业农村部提出。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。

本标准起草单位z中国兽医药品监察所。

本标准主要起草人2王琴、赵启祖、徐璐、王在时、张乾义、夏应菊、范学政、邹兴启、朱元源、李翠、

丘惠深、赵耘、徐嫁。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为＝

一一－GB/T16551-20080

m

GB/T16551-2020

言

百｜

猪瘟（Classicalswinefever,CSF）是由猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV）感染猪引起的

一种高度接触性致死性传染性疾病，可造成巨大的经济损失和社会影响。被世界动物卫生组织（OIE)

列为必须报告的疫病，我国规定CSF为一类动物疫病。

猪包括野猪是本病唯一的自然宿主，发病猪和带毒猪是本病的传染源，不同年龄、性别、品种的猪均

易感，一年四季均可发生。感染猪在发病前能通过分泌物和排泄物排毒，并持续整个病程。与感染猪直

接接触是本病传播的主要方式，病毒也可通过精液、胚胎、猪肉和对水等方式间接传播，人、其他动物如

鼠类和昆虫、器具等均可成为重要传播媒介。

CSFV是黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的成员之一，只有1个血清型，3个基因型，

10个基因亚型，不同基因型间有很好的抗原交叉反应。近年来，由于临床上出现了CSFV持续性感染

所致的无典型临床症状和病理变化的慢性和隐性感染形式，以及多种疫病混合感染的现象，CSF的临

床诊断和病理学诊断只能作为初步诊断的依据，对臼F病原的实验室检测是确定病毒感染的主要方

法，要求诊断技术和标准更加特异和敏感。由于诊断的需求和诊断技术的发展，GB/T16551-2008已

经不适应要求。针对臼F感染普遍存在病毒载量低、病毒血症时间短等特点，最适用于活体动物的检

测样本首先是扁桃体，其次为抗凝全血g若为病死动物，可采集扁桃体、脾脏、肾脏、腕脏、回肠、回盲瓣、

肠系膜淋巴结和领下淋巴结等含毒量较高的脏器进行检测。采用CSFV抗原免疫检测法［免疫荧光抗

体试验（Fluorescentantibodytest,FAT）／免疫过氧化物酶试验Ommunoperoxidasetest,IPT）］可检测

感染组织和细胞中的病毒抗原，用于确诊s如果结果可疑或者样本不足，可以通过核酸检测技术确认．

如果样本量大，可采用猪瘟病毒实时荧光RTPCR检测方法进行初筛，阳性者采用猪瘟病毒RTnPCR

检测方法和序列测定进行确诊和基因分型g上述都不能确诊的样本，采用经典的CSFV分离技术确诊，

分离的病毒可用于进一步研究。上述三类方法均为OIE推荐的方法。

目前，实施CSF疫苗全面免疫是我国防控CSF的重要手段，CSFV抗体检测主要用于CSF疫苗的

免疫效果评价，而对于一些不实施免疫CSF疫苗的国家和地区来说，CSF抗体检测可以作为未免疫猪

瘟疫苗猪群感染CSF的诊断依据。而在我国，ELISA方法已成为监测免疫后CSFV抗体保护水平、评

价猪群免疫效果的最主要手段，根据检测目的不同，可选择不同的方法。对于我国CSF疫苗采取的全

面免疫后而开展的大规模普查，间接ELISA抗体检测方法能够更加真实地反映中和抗体水平，为免疫

程序制定和抗体水平监测提供可靠的数据支持5阻断ELISA抗体检测方法因其特异性强，可用于引种

的种猪检测s化学发光抗体检测方法是近年来发展起来的一种新的酶联免疫检测方法，利用化学发光底

物提高检测的灵敏度，同时增加检测的线性范围。本标准中的CSFV化学发光抗体检测方法中采用了

CSFV抗体的校准品，并在检测中绘制校准曲线，可以使抗体检测结果相对定量。另外，采用该方法进

行检测，能够大大缩短检测时间，适应于田间推广使用。最终的抗体确认可采用“金标准”方法病毒中和

试验（Virusneutralizationtest,VNT）。ELISA方法和VNT两类方法均为OIE推荐的方法，也是国际

贸易指定试验。

本标准中涉及了5种CSF病原和4种CSFV抗体的实验室检测方法，均可用于CSF病原和抗体的

定性检测。使用者可根据自身的实验条件、能力水平以及待检样本的实际情况选择合适的方法。

本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及7.2和7.3与CSFVE2蛋白表达及纯化

相关的专利的使用。

本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。

该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，

N

GB/T16551-2020

就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下

联系方式获得＝

专利持有人姓名z中国兽医药品监察所。

地址：北京中关村南大街8号。

请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专

利的责任。

v

GB/T16551-2020

猪瘟诊断技术

1范围

本标准规定了猪瘟的临床症状与病理变化，样本的采集、保存、运输和处理，实验室病原学诊断方法

以及实验室抗体检测方法等。

本标准适用于猪（家猪、野猪）的猪瘟诊断。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本

文件。凡是不注目期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27540猪瘟病毒实时荧光RTPCR检测方法

GB/T347292017猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法

GB/T35906猪瘟抗体间接ELISA检测方法

GB/T36875猪瘟病毒RT-nPCR检测方法

NY/T541兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CSF：猪瘟（Classicalswinefever)

CSFV：猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus)

EDTA：乙二胶四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid)

ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay)

FAT，免疫荧光抗体试验（Fluorescentantibodytest)

FITC：异硫氨酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate)

HRP：辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase)

IPT：免疫过氧化物酶试验Ommunoperoxidasetest)

MEM：基础Eagle培养基（Minimumeagle'smedium)

NCU：国家临床单位（Nationalclinicalunit)

NIF：免疫荧光中和试验（Neutralization-immunofluorescence)

NPLA，过氧化物酶联中和试验（Neutralizationperoxidase-linkedantibody)

PBS：磷酸盐缓冲溶液（Phosphatebufferedsaline)

PK-15：猪肾传代细胞系（Pigkidney-15cellline)

RT-nPCR：巢式PCR技术（Reversetranscriptionnestpolymerasechainreaction)

RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction)

TCID502组织半数感染剂量（50%tissuecultureinfectivedose)

1

GB/T16551-2020

4临床症状与病理变化

4.1I临床症状

猪群中被检猪出现下列临床症状时，可作为综合诊断定性的依据之－，

a)发病急、病死率高g

b)体温》40.5℃或间歇性发热g

c)精神萎靡、畏寒、厌食甚至废食，呕吐、步态不稳或肢行g

d）先便秘后腹泻，或便秘和腹泻交替出现g

e)腹部皮下、鼻镜、耳尖、四肢内侧均可出现紫色出血斑点，指压不褪色，结膜炎p

f)怀孕母猪有流产、死胎、“木乃伊”胎或所产仔猪有衰弱、震颤、瘟孪、发育不良等现象。

4.2病理变化

对I临床检出的可疑患猪可进行病理学诊断，下述肉眼可见的病理变化可作为综合诊断定性的依据

之－，

a)淋巴结水肿、出血，呈现红白相间“大理石样变”z

b)肾脏呈土黄色，表面可见出血点，部分病例可见雀斑肾g

c)全身浆膜、秸膜和心脏、膀脱、胆囊、扁桃体均可见出血点和出血斑s

d)脾脏不肿大，表面有点状出血或边缘出现突起的模状梗死区g

e)慢性CSF在回肠末端、盲肠和结肠常见“纽扣状”溃E草。

4.3结果判定

易感猪出现4.1或4.2的情况，可判定为疑似CSF"

确诊应采集有临床症状或病理变化的猪的扁桃体、脾脏、肾脏、腕脏、回肠、回盲瓣、肠系膜淋巴结和