GB/T 16551-2008 猪瘟诊断技术

GB/TXXXX—XXXX

ICS11.220

B41

中华人民共和国国家标准

GB/TXXXX—XXXX

代替GB16551—2008

猪瘟诊断技术

DiagnosticTechniquesforClassicalSwineFever

(征求意见稿)

XXXX—XX—XX发布XXXX—XX—XX实施

Ⅰ

GB/T××××—××××

前言

本标准代替GB16551—2008《猪瘟诊断技术》，除编辑性修改外，主要技术变化如下：

———本标准修订了GB16551－2008标准中第1“范围”中有关内容，并对各种方法的

基本用途做出解释。

———本标准修改了GB16551－2008标准中“猪瘟的临床及病理学诊断”部分，对每一

项内容更加准确和简明。

———本标准增加了“猪瘟疑似样本的采集和处理”部分，分为“猪瘟样本的采集、保

存与运输”和“猪瘟组织样本的处理”2个内容。该部分内容的增加，规范了猪瘟疑似样本的

采集、保存与运输以及处理，对于准确诊断和检测具有重要的意义。

———本标准对GB16551－2008标准中“实验室病原学诊断”内容进行了大幅度修改，

新增了2个核酸检测方法。保留了兔体交互免疫试验并进行了修改；并将“免疫酶染色试验”、

“病毒分离与鉴定试验”和“直接免疫荧光抗体试验”分别更名为“免疫过氧化物酶检测

（IPT）”、“猪瘟病毒分离与鉴定”和“荧光抗体检测（FAT）”，并对其内容进行了完善、补

充和大幅度修改；对GB16551－2008版中的“猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应（RT-nPCR）”，

经完善和修订后作为另外一个单独的国标（GB/T36875-2018），在本标准中又将其纳入为6.5；

将通用猪瘟病毒的核酸检测方法“猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法”（GB/T27540-2011）

纳入本标准中，成为6.6；在本标准中增加“猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB鉴别荧光RT-PCR

检测方法”，适用于鉴别猪瘟病毒疫苗毒和野毒的核酸检测方法，成为6.7。

———本标准对GB16551－2008标准中“实验室血清学检测方法”内容进行了大幅度补

充和修改，完善了1种方法，删除了1种方法，新增加了4种方法。由于猪瘟病毒中和试验

包括荧光抗体病毒中和试验（NIF）和过氧化物酶联中和试验（NPLA），NIF与NPLA的原理相

同，操作程序相同，只是所用染色方法不同。因此将GB16551－2008标准中“荧光抗体病毒

中和试验”更名为“猪瘟病毒中和试验”，增加了“过氧化物酶联中和试验”并对内容进行了

完善和较大幅度的修改；增加了猪瘟抗体效价检测中和抗体法（猪瘟病毒兔体中和试验）；由

于原标准中的猪瘟单抗酶联免疫吸附试验，目前尚无推广应用，因此删除此方法；有关抗体

检测的各种ELISA方法，纳入已发布的GB/T34729-2017《猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法》

和GB/T35906-2018《猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法》。根据OIE手册的要求，采用的ELISA

方法可以是竞争、阻断和间接法，尽量减少与BVDV和其它瘟病毒的交叉反应，还需要保证其

敏感性，根据该要求，将化学发光分析技术（(ChemiluminescenceImmunoassay，CLIA)与免

疫学技术结合，采用一步竞争法建立了猪瘟病毒化学发光抗体检测试剂盒，提高了猪瘟抗体

ELISA检测的敏感性、特异性和稳定性，因此在本标准中增加了《猪瘟病毒化学发光抗体检测

方法》。

本标准按照GB/T1.1-2009的规则起草。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。

本标准起草单位：中国兽医药品监察所。

本标准主要起草人：王琴、赵启祖、徐璐、王在时、张乾义、夏应菊、范学政、邹兴启、

朱元源、李翠、丘惠深、赵耘。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

——GB16551—2008。

猪瘟诊断技术

1范围

本标准规定了猪瘟（Classicalswinefever,CSF）临床诊断、病理学诊断、样本的采集和

处理以及实验室诊断方法的技术要求，其目的是规范猪瘟的诊断技术，达到标准化程度。

根据猪瘟病毒（ClassicalswinefeverVirus,CSFV）感染后猪瘟的病程长短、临床症状和

病理变化，可将猪瘟分为最急性型、急性型和亚急性型、慢性型和持续感染型等形式。依据典

型的临床症状、病理变化可作出初步诊断，确诊需要通过实验室诊断方法。

猪瘟临床诊断部分规定了猪瘟的临床诊断、病理学诊断技术。

猪瘟疑似样本采集部分规定了样本的采集、保存和运输，组织样本的处理部分规定了样本

的前处理要求。

猪瘟实验室诊断方法部分规定了病原学诊断技术和血清学诊断技术。猪瘟病原学诊断技术

包括兔体交互免疫实验、免疫学技术、病毒分离技术和各种新型核酸检测技术；猪瘟血清学诊

断技术包括猪瘟抗体病毒中和实验和各种猪瘟酶联免疫吸附实验。

本标准中，猪瘟病原学诊断技术包括兔体交互免疫试验、猪瘟病毒荧光抗体检测

（Fluorescentantibodytest，FAT）、猪瘟病毒免疫过氧化物酶检测（Immunoperoxidasetest，

IPT）、猪瘟病毒分离与鉴定、猪瘟病毒RT-nPCR检测方法、猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测

方法和猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB鉴别荧光RT-PCR检测方法。兔体交互免疫实验是对病料

中是否含有猪瘟活病毒一种经典的动物实验检测方法；猪瘟病毒荧光抗体检测（FAT）方法和猪

瘟病毒免疫过氧化物酶检测（IPT）方法原理相同，但抗体标记物不同，二者都可以快速、特异

的检测扁桃体、淋巴结、脾脏、胰脏、肾脏和回肠远端等组织样品的冰冻切片或触片以及细胞

培养物中的病毒抗原；猪瘟病毒分离技术是实验室检测与鉴定中常用的标准方法，采用敏感细

胞系进行活病毒的分离和鉴定，分离到的病毒可以用于基因分型及分子流行病学调查等进一步

的研究；猪瘟病毒核酸检测技术在灵敏度上较上述方法呈现数量级的提高，通过特异性引物和

探针的设计实现了对猪瘟病毒目的基因的检测，还可实现野毒株和疫苗株的鉴别诊断，可用于

疑似猪瘟病毒感染猪活体扁桃体、各类组织、脏器、血液、粪便和细胞培养物中的病毒核酸检

测。本标准纳入的猪瘟病毒RT-nPCR检测方法适用于猪瘟的诊断和监测，已成为国内外猪瘟病

毒检测和分子流行病学研究的标准方法，获得的猪瘟病毒扩增序列可用于进一步基因分型；本

标准纳入的猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法可通用于所有基因型猪瘟病毒核酸检测和高通

量样本的快速筛查；本标准新增加的猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB鉴别荧光RT-PCR检测方法

能够特异性的检测猪瘟野毒核酸。

本标准中，猪瘟血清学诊断技术包括兔体中和实验、细胞中和实验、猪瘟病毒间接ELISA

抗体检测方法、猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法和猪瘟病毒化学发光抗体检测方法。兔体中

和法是我国2015年版《中国兽药典》（三部）中规定的采用兔体进行猪瘟病毒中和抗体效价检

测方法，至今一直沿用；细胞中和实验根据抗体标记物的不同可分为荧光抗体病毒中和实验

（Neutralization-immunofluorescence，NIF）和过氧化物酶联中和实验（Neutralization

peroxidase-linkedantibody，NPLA），二者均为国际贸易指定的猪瘟抗体确诊方法，是国际公

认检测CSFV抗体的标准方法；本标准中猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法和猪瘟病毒阻断

ELISA抗体检测方法均为国际贸易指定试验，和猪瘟病毒化学发光抗体检测方法也均适用于猪

血清中抗体的检测。

本标准适用于猪瘟的临床诊断、样本的采集和处理和实验室诊断。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适

用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB16551—2008猪瘟诊断技术；

《欧盟猪瘟实验室诊断手册》（2007年）；

《猪瘟防治技术规范》农业部，2012；

《猪瘟》[M]王琴，涂长春.北京：中国农业出版社,2015；

《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样品运输包装规范》（农业部公告第503号）；

《国家民航局关于运输动物菌毒种样本病料等有关事宜的通知》（局发明电〔2008〕4487

号）；

《兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范》（NY/T541-2016）

《陆生动物诊断试验和疫苗手册》世界动物卫生组织（OIE）（2017年版）2.8.3章

3.缩略语

下列缩略语适用于本标准。

BSA：Albuminfrombovineserum，牛血清白蛋白

CSF：ClassicalSwineFever，猪瘟

CSFV：ClassicalSwineFeverVirus，猪瘟病毒

CLIA：ChemiluminescenceImmunoassay，化学发光免疫检测

CT值：CycleThreshold，达到阈值的循环数

cDNA：ComplementaryDNA，互补脱氧核糖核酸

C株：C-strain，猪瘟兔化弱毒疫苗

5

CO：carbondioxide，二氧化碳

2

CPE：cytopathiceffect，致细胞病变效应

DEPC：DiethylPyrocarbonate，焦碳酸二乙酯

EDTA：Ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸

ELISA：Enzymelinkedimmunosorbentassay，酶联免疫吸附试验

FAT：Fluorescentantibodytest，荧光抗体检测技术

FAM：6-carboxy-fluorescein，6-羧基荧光素

FBS：FetalBovineSerum，胎牛血清

FITC：异硫氰酸荧光素

C-株：hogcholeralapinizedvirus，猪瘟兔化弱毒疫苗株

HRP：HorseradishPeroxidase，辣根过氧化物酶

IgG-HRP：ImmunoglobulinG-HorseradishPeroxidase，免疫球蛋白-辣根过氧化物酶

IPMA：Immunoperoxidasemonolayerassay，免疫过氧化物酶细胞单层试验

IPT：Immunoperoxidasetest，免疫过氧化物酶检测技术

KCL：Potassiumchloride，氯化钾

KHPO4：PotassiumPhosphateMonobasic，磷酸二氢钾

2

MEM：minimumEagle’smedium，低限量Eagle培养基

MGB：MinorGrooveBinder，小沟结合物

NaCl：Sodiumchloride，氯化钠

NaHPO∙12HO：Disodiumphosphatedodecahydrate，十二水∙磷酸氢二钠

242

NCU:nationalclinicalunit，国家临床单位

NIF：Neutralization-immunofluorescence，荧光抗体病毒中和试验

NPLA：Neutralizationperoxidase-linkedantibody，过氧化物酶联中和试验

PBS：phosphatebuffersaline，磷酸盐缓冲溶液

PCR：Polymerasechainreaction，聚合酶链式反应

PK15细胞：猪肾细胞

RNA：Ribonucleicacid，核糖核酸

ROX：Carboxy-X-Rhodamine，5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯

RT：ReverseTranscription，反转录

RT-PCR：Reversetranscriptionpolymerasechainreaction，反转录聚合酶链式反应技术

RT-nPCR：Reversetranscriptionnestpolymerasechainreaction，反转录巢式PCR技术

荧光RT-PCR：Realtimefluorescentquantitativereversetranscriptionpolymerase，实时荧光反

转录聚合酶链式反应

TAMRA：Carboxytetramethylrhodamine，6-羧基四甲基若丹明

TCID50：Tissuecultureinfectivedose，组织半数感染剂量

VNT：Virusneutralizationtest，病毒中和试验

4猪瘟的临床及病理学诊断

4.1临床及病理学诊断的作用

猪感染CSFV后的临床症状和病理变化因毒株致病力、感染病毒载量和宿主等因素不同而

有很大差异。随着猪瘟疫苗的大规模使用，猪瘟的流行特点、症状和病理变化表现出非典型和

慢型特征。猪瘟的确诊必须依赖于对CSFV的实验室诊断，才能形成最终的确诊。

4.2临床诊断

本标准规定本病潜伏期为3-10天，隐性感染可长期带毒。根据临床症状可将本病分为急性、

亚急性、慢性和持续感染性四种类型。被检猪出现下列临床症状时,可作为综合诊断定性的依据

之一:

4.2.1发病急、死亡率高；

4.2.2体温在41℃以上或间歇性的发热；

4.2.3精神萎靡、畏寒、厌食、甚至废食,呕吐、步态不稳；

4.2.4先便秘后腹泻，或便秘和腹泻交替出现；

4.2.5腹部皮下、鼻镜、耳尖、四肢内侧均可出现紫色出血斑点，指压不褪色，结膜炎；

4.2.6怀孕母猪有流产、死胎、木乃伊或所产仔猪有衰弱、震颤、痉挛、发育不良等现象。

出现上述症状时，猪只作为可疑猪瘟对待，应全群隔离饲养，并作进一步诊断。

4.3病理学诊断

对临床检出的可疑猪可进行病理学诊断，下述肉眼可见的病变可作为综合诊断定性的依据

之一：

4.3.1淋巴结水肿、出血，呈现红白相间“大理石样变”；

4.3.2肾脏呈土黄色，表面可见针尖状出血点；

4.3.3全身浆膜、黏膜和心脏、膀胱、胆囊、扁桃体均可见出血点和出血斑；

7

4.3.4脾脏不肿大，表面有点状出血或边缘出现突起的楔状梗死区；

4.3.5慢性猪瘟在回肠末端、盲肠和结肠常见“钮扣状”溃疡。

5猪瘟疑似样本的采集

5.1猪瘟样本的采集、保存与运输

5.1.1采样工具

5.1.1.1扁桃体采样器：鼻捻子、开口器和采样枪。使用前均用3%氢氧化钠溶液浸泡消毒

5min～10min，经清水冲洗。

5.1.1.2灭菌牙签和1.5mL或2mL离心管经（121±2）℃高压灭菌15min；剪、镊经160℃

干烤2h。

5.1.1.3DEPC水、4%EDTA溶液或EDTA抗凝管。

5.1.1.4组织匀浆器或研磨器、离心机。

5.1.2样品采集

5.1.2.1活体样品

固定活猪的上唇，用开口器打开口腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌牙签挑至1.5mL

或2mL离心管并作标记，编号。取待检样品，按1mL/g体积比加入DEPC灭菌水，于研钵或

组织匀浆器中充分研磨，3000g离心5min，取上清液转入离心管中编号备用。

5.1.2.2内脏样品

采取病死猪或扑杀猪各种脏器（淋巴结、胰脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏）装入一次性塑

料袋或其他灭菌容器，编号。取0.5g～1g待检样品，按1mL/g体积比加入DEPC灭菌水，于研

钵或组织匀浆器中充分研磨，3000g离心5min，取上清液转入离心管中编号备用。

5.1.2.34%EDTA抗凝血

用无菌注射器采集全血，注入含1/10V4%EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀后编号备用。

5.1.2.4排泄物

用灭菌牙签挑取少许粪便样本于离心管中，加入适量生理盐水，震荡混匀，室温3000g离

心5min，取上清液转入离心管中编号备用。其余液体排泄物直接转入离心管编号备用。

5.1.2.5细胞培养物

细胞培养物冻融3次，转入离心管中编号备用。

5.1.3保存与运送

5.1.3.1样品应置于保温容器中运输，保温容器应密封，防止渗漏。一般使用保温箱或保温

瓶，保温容器外贴封条，封条有贴封人（单位）签字（盖章），并注明贴封日期。

5.1.3.2样品应在规定的温度下运输，组织样品可以暂时冷藏处理，然后立即运送实验室。

5.1.3.3各种样品到达实验室后，应按有关规定冷藏或冷冻保存。长期保存的样品应超低温

冷冻（以-70℃或以下为宜）保存，尽量避免反复冻融。

5.1.4注意事项

5.1.4.1采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本不得交叉污染。

5.1.4.2采集不同猪的扁桃体样本时，鼻捻子、开口器和采样枪在使用前均用3%氢氧化钠

溶液浸泡消毒5min～10min，经清水冲洗后方可使用。

5.1.4.3所有操作必须由经过专业培训的人员在指定的工作区域内进行。处理不同猪的组织

病料应更换手套，避免交叉污染。

5.2猪瘟组织样本的处理

5.2.1实验材料/仪器设备

5.2.1.1无菌眼科剪、眼科镊、无菌离心管（2mL/5mL）、无菌钢珠、无菌移液器吸头（1000

μL）。

5.2.1.2无菌MEM培养液（含2%双抗）、匀浆机、离心机。

5.2.2操作

5.2.2.1将病料用无菌眼科剪和眼科镊进行修剪（病灶与健康组织的交界处），取1g大小的

病料组织，置于无菌离心管（预先放置无菌钢珠）中，再向其中加入无菌MEM培养液1mL。

（注：采取不同组织要更换剪刀、镊子，不能一把工具采样到底。）

5.2.2.2置于匀浆机中匀浆，400rate/min，每次30s，间隔10s后再重复匀浆一次。匀浆后，

3000g离心5min，取上清，置于另一个无菌离心管中。若该样本在4～8h内检测，则保存于2～

8℃冰箱中；若短期内不检测，则应在-40℃以下保存。

5.2.3存放与运送

采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，

但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品放入样品管中密封后，采用保温容器加冰袋

或干冰密封，在6h~8h之内运送到实验室。样品相关生物安全标识和运送流程应按照《高致病

性动物病原微生物菌（毒）种或者样品运输包装规范》、《国家民航局关于运输动物菌毒种样本

病料等有关事宜的通知》和《兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范》进行。

5.2.4注意事项

5.2.4.1进行猪瘟病毒分离推荐采集的组织样本为：扁桃体、颌下淋巴结、肾脏、脾脏、回