YY/T 1295-2015 医疗器械生物学评价 纳米材料：细菌内毒素试验

ICS11.040.30

C30

中华人民共和国医药行业标准

/—

YYT12952015

医疗器械生物学评价

:

纳米材料细菌内毒素试验

ㅤㅤㅤㅤ

—:

BioloicalevaluationofmedicaldevicesNanomaterial

g

Endotoxintest

[:,—

ISO297012010NanotechnoloiesEndotoxintestonnanomaterial

g

—(),]

samlesforinvitrosstemsLimulusameboctelsateLALtestMOD

pyyy

2015-03-02发布2016-01-01实施

国家食品药品监督管理总局发布

/—

YYT12952015

目次

前言…………………………Ⅰ

1范围………………………1

2规范性引用文件…………………………1

3术语和定义………………1

4缩略语……………………2

5试验前准备………………2

6供试品……………………3

7供试品制备………………3

8试验方法…………………4

结果评价…………………5

9

10试验报告………………6

()…………

附录A资料性附录鲎试验潜在干扰的举例7

()……………

附录B资料性附录凝胶法8

()………………………

附录C资料性附录终点光度法11

ㅤㅤㅤㅤ

()……………

附录D资料性附录动态法14

()………

附录E资料性附录本标准与国际标准章条编号对照一览表和技术性差异及原因一览表16

参考文献……………………18

/—

YYT12952015

医疗器械生物学评价

:

纳米材料细菌内毒素试验

1范围

,。

本标准描述了应用鲎试验评价纳米材料用于细胞的体外生物学试验系统

(:、),

本标准适用于能够被水性介质例如水血清或反应介质分散或浸提的纳米材料使纳米材料与

这种介质在37℃培养适当的时间。

,。

本标准仅限于体外试验的样本该方法也可适用于经非肠道途径进行动物给药的纳米材料

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文

。,()。

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/:(/—

医疗器械生物学评价第部分样品制备与参照样品

GBT16886.1212GBT16886.12

,:,)

2005ISO10993-122002IDT

/:(/—,

洁净室及相关受控环境第部分空气洁净度等级

GBT25915.11GBT25915.12010

:,)

ISO14644-11999IDT

ㅤㅤㅤㅤ

/:/

洁净室及相关受控环境第部分证明连续符合的检测与监测

GBT25915.22GBT25915.1

技术条件(/—,:,)

GBT25915.22010ISO14644-22000IDT

/:(、、、

洁净室及相关受控环境第部分隔离装置洁净风罩手套箱隔离器微环

GBT25915.77

境)(/—,:,)

GBT25915.72010ISO14644-72004IDT

()

中华人民共和国药典三部2010年版

::(

医疗器械生物学评价第部分样品制备与参照样品

ISO10993-12200712Bioloicalevalua-

g

—:)

tionofmedicaldevicesPart12Samlerearationandreferencematerials

ppp

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

凝固蛋白原coauloen

gg

鲎试剂中在内毒素引起的凝胶形成中起主要作用的凝固蛋白。

:,。

注凝固蛋白原由175个氨基酸组成相对分子质量为19723

3.2

凝固蛋白coaulin

g

鲎试剂中的凝固酶原激活物将凝固蛋白原转化为凝固蛋白。

:()()。

注凝固蛋白由末端片段多肽和末端片段多肽组成

NAla1-Ar18CGl47-Phe175

gy

3.3

内毒素endotoxin

革兰氏阴性菌细胞壁外膜的一种成分。

1

/—

YYT12952015

:()。

注主要的活性部分是脂多糖LPS

3.4

内毒素单位;

endotoxinunitEU

内毒素活性标准单位。

注:,(

1内毒素单位由的在年作出定义即参考标准内毒素来源于埃希氏大肠杆菌

WHOECBS19960.1nWHO

g

::())或/。

0113HK10K-10EUng

注:相当于内毒素的国际单位()。

2EUIU

3.5

灵敏度sensitivit

y

λ

凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度或浊度法和显色基质法标准曲线的最低灵敏度。

:/。

注单位为EUmL

3.6

鲎试剂limulusameboctelsate

yy

美洲鲎或东方鲎的血细胞中提取的水状物。

3.7

鲎试验limulusameboctelsatetest

yy

细菌内毒素的检查法。

:。

注鲎试验在药典中称为细菌内毒素试验

3.8

光密度;

oticaldensitOD

py

ㅤㅤㅤㅤ

特定波长下光物质的吸光度。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

:()

BET细菌内毒素试验bacterialendotoxintest

:()

CSE对照标准内毒素controlstandardendotoxin

:()

ECBS生物标准化专家委员会exertcommitteeonbioloicalstandardization

pg

:()

EF无细菌内毒素endotoxin-free

:()

EU细菌内毒素单位endotoxinunit

/:/(/)

IEC抑制增强对照inhibitionenhancementcontrol

:()

LAL鲎试剂Limulusameboctelsate

yy

:()

LPS脂多糖lioolsaccharide

ppy

:()

OD光密度oticaldensit

py

:()

RSE参考标准内毒素referencestandardendotoxin

:()

WHO世界卫生组织Worldhealthoranization

g

5试验前准备

5.1纳米材料的贮存

()。,

纳米材料由于表面积大可以吸附环境中的很多污染物包括内毒素因此纳米材料使用前应贮

()。

存在无细菌内毒素的可密封的容器里如玻璃容器

2

/—

YYT12952015

注:,()。

1塑料制品如聚丙烯宜避免用于贮存纳米材料因为可能对鲎试验产生干扰见附录A

注2:无内毒素的氧化物粉末可以通过热处理获得。

5.2贮存容器

用于贮存纳米材料和供试品的玻璃容器和其他对热稳定的容器宜在250℃至少加热30min或者

,,。。

180℃至少3h或者650℃1min也可以使用市售的无菌无内毒素的聚苯乙烯容器

5.3纳米材料的处理

,。

室内环境中的尘埃含有大量的内毒素取样和操作过程中要避免尘埃与纳米材料的接触实验室

()。

的空气应清洁见7.5

6供试品

6.1分散液

能够分散在水溶液中的纳米材料可以直接或用无内毒素水稀释后用于鲎试验。

6.2浸提液

,。

纳米材料经无内毒素反应介质生理盐水或其他浸提介质浸提后用于鲎试验

7供试品制备

ㅤㅤㅤㅤ

7.1分散方法

分散过程可以经过下列一个或多个步骤:

———手工研磨;

———机械研磨;

———超声。

分散介质依据体外试验的目的和特点而定。

:,、。,。

注纳米材料有大的表面积多孔性疏水性和其他特性使这一步骤变得困难因此分散方法需发展提高

7.2浸提方法

,、、。

浸提条件比如浸提介质浸提时间浸提温度和供试品的浓度可以参照相关体外试验的浸提条件

(),。

没有pH指示剂如苯酚红的反应介质或缓冲盐溶液是更适合的浸提介质以避免颜色的干扰浸提

。

介质应被证实是无内毒素的或是由无内毒素的试剂配制而成的浸提介质中添加抗生素和抗真菌药可

。()。

有效地防止细菌和真菌的生长要证实添加的抗生素对鲎试验有无干扰参见8.3.3浸提后浸提物

,。

应该离心后除去颗粒应将上清液用无内毒素吸头收集到无内毒素试管或容器中作为鲎试验的样品

。。

浸提条件包括离心都应被证实和记录特别是离心条件应根据涉及的纳米材料确定

:。

注推荐使用的聚山梨醇酯作为来自玻璃纤维过滤器的可在空气中传播的内毒素浸提介质

10.05%20

:()

注的维生素表面活性剂维生素生育酚聚乙烯琥珀酸盐可以提高来自碳纳米物质中

20.1%EEd-αlcol-1000

gy

的内毒素的浸出量。

:/:。

注更多浸提方法的资料参见及

3GBT16886.12ISO10993-122007

7.3浓度

,。

必要时供试品应加无内毒素水至体外细胞试验中确定的最高浓度

3

/—

YYT12952015

7.4供试品的贮存

,。

供试品制备后尽快使用因为贮存时可能发生内毒素含量下降或细菌量增长的情况供试品应被

(),。,

贮存在无内毒素的可密封容器内见5.2温度在2℃~8℃如果供试品贮存超过24h应证实该贮

存条件下样品的稳定性和均一性。

7.5实验室环境

7.5.1水和空气清洁度

。

室内环境中的水和尘埃通常含有大量的内毒素纳米材料应使用无内毒素介质和无内毒素器皿以

。,

保证无菌样品制备实验室环境中应使用一个清洁的房间一个清洁的空气罩或者一个同等的洁净度

()(/)。/、/

为ISO5级百级的空气净化装置GBT25915.1空气净化指南见GBT25915.1GBT25915.2

和/。

GBT25915.7

7.5.2器材和实验室器皿

,

用于制备供试品的器材和实验室器皿应该在250℃以上至少干热30min或者180℃至少3h或

。,。

者650℃1min以除去内毒素不适合加热的对热不稳定的材料应使用其他除内毒素方法材料用

。,

强碱或氧化液浸泡后用无内毒素水清洗是一个可信的除去内毒素的方法如果使用强碱或氧化液方

,。

法需要被证实以确保除去内毒素并且没有可能干扰试验的残余物留存关于对热不稳定的实验室器

、、。

皿如容器试管吸头等无内毒素塑料制品可从商业渠道购买

7.5.3冲洗用水

ㅤㅤㅤㅤ

。

水是器材和器皿中检测到内毒素的来源之一实验室器材和器皿去除内毒素处理后可用蒸馏水冲

。,

洗蒸馏已被证实可除去污染水中的内毒素但制备蒸馏水时有可能由于不合适的设备和不准确的操

。

作方式导致内毒素污染在室内制备的蒸馏水应该定期测量内毒素水平以确保水中仅含有极低水平的

。,。

内毒素如果蒸馏水中的内毒素污染是无法避免的就应该使用市售的无内毒素水

8试验方法

8.1原理

。

内毒素激活鲎试剂中的一个因子并引发蛋白级联反应其中一个活化因子将凝固酶原激活为凝固

,,,

酶凝固酶催化鲎试剂中的凝固蛋白原转化为凝固蛋白并通过二硫键自然地彼此结合形成鲎试剂的

。。

混浊并最终形成凝胶判断凝胶形成主要通过倒置试管用眼睛去观察这个方法不需要光度计就能完

。/。

成这些步骤使用市售试剂的凝胶法其最灵敏的测定值是0.015EUmL

:。

注凝胶法描述在附录B

8.2可替代的试验方法

8.2.1终点法

。:

经过一定的反应时间测量反应混合物的光密度与终点光密度有关的方法有两种浊度法和测量

(,)。

对硝基苯胺-nitroaniline-NA的显色基质法由于灵敏度低和技术上要在一个指定时间点固定浊

pp

,,。

度有困难这种简单的终点浊度法被动态浊度法取代见8.2.2至少有两种方法检测反应混合物中的

p-NA:

———直接在405nm波长检测p-NA的光密度;

4

/—

YYT12952015

———在和之间的波长检测的重氮基品红衍生物。

540nm550nmp-NA

市售的终点光密度法的试剂在波长检测/,

405nmOD的检测限是0.01EUmL重氮显色法的检测

限是/。

0.001EUmL

:。

注终点光度法描述在附录C

8.2.2动态法

。,

通过光度仪测定反应混合物的显色速率或浊度达到预定OD的时间由于是动态的方法在反应

,

过程中的多个时间点都能读出从合成肽释放的的值或反应混合物的浊度的值因此有

p-NAODOD

。,

几种类型的自动化计算工具得到发展为了用动态法更加精确和准确地测量内毒素可以使用精密的

。,/。

自动化检测仪器使用商业上销售的自动化工具进行动态法最高检测限可达到0.001EUmL

8.3试验方法的选择和确认

8.3.1最低检测限或最低灵敏度

在体外试验中产生生物学反应的内毒素临界浓度是依据使用的体外试验系统而变化的。/

0.01nmL

g

,

内毒素引起人的巨噬细胞释放和而0.048n内毒素引起人树突状细胞或外周血单核细胞

IL-1TNF-αg

β

。,。

的生物学反应不明显最好是知道体外试验系统容许污染的内毒素水平以选择合适的鲎试验鲎试

剂的灵敏度应高于或至少等于容许的相关体外试验的内毒素污染水平。

8.3.2由供试品引起的潜在的抑制或增强作用

。,

已报道有几种材料会干扰鲎试验新近合成的一些纳米材料由于他们的特性还不清楚对鲎

试验有无潜在的抑制或增强作用。

ㅤㅤㅤㅤ

:。

注附录给出潜在的干扰的举例

A

。

在使用终点法或动态法时供试品的颜色或浊度有可能引起干扰应依据供试品的光学特性选

择试验方法。

8.3.3试验方法的确认

纳米材料对内毒素试验的干扰作用可以通过对已知或未知内毒素量的供试品的系列稀释进行

验证。

:、。

注试验方法见附录附录和附录

1BCD

:《()》()。

注试验方法的验证要求见中华人民共和国药典三部版附录

22010ⅫE

。

鲎试剂反应的最佳pH在6~8之间当试验被抑制时应测量试验样品和鲎试剂组成的反应

。,。

混合物的值如果应调整要调整试验样品的使反应混合物的在上述最佳