GB/T 22287-2008 贝类中甲型肝炎病毒检测方法 普通RT—PCR方法和实时荧光RT—PCR方法

‘

ICs67100

X04

中华人民共和国国家标准

GB/T22287—2008

贝类中甲型肝炎病毒检测方法

普通RT—PCR方法和

实时荧光RT—PCR方法

Detectionofhepatitisavirusinshellfish-

ContentionalRT-I'CRandreal-timefluorescenceRT-PCR

2008-08-12发布⒏002实10-21

施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

o"EE"'中国国家标准化管理委员会

HEMfi

GB/T22287-2008

日刂吕

Λ

本标准的附录为规范性附录.

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.

本标起草单:中人民共fn国北出人验检局、人民和国江出人检

准位华京境检疫中华共苏境验检

疫局。

本标准上要起人:陈全、红、、、、、、、、.

莘广饶段洪安冯骞付溥膊张惠媛汪琦曾静张睿李金华

CB/Γ22287-2008

贝类中甲型肝炎病毒检测方法

普通RT—PCR方法和

实时荧光RT-PCR方法

I范围

本标准规定了贝类中甲型肝炎病毒的普通RTPCR和荧光RTPCR检测方法.

本标准适用于贝类中甲型肝炎病蓐核酸的检测。

2规范性引用文件

卜列文的条款通的。凡日,其

件中过本钚准引用而成为本标准的条款是注期的扌l丿lJ文作随后所礻f

的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准、而,鼓

然励根据本标准达成协议的各方研究

nr使.凡,其

是否用这些文件的最新版本是不注日期的引川文件最新版本适用于本标准.

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GlJ/T66822008,IS03696:1987,M()D)

GI;l阢89实验窀生物安全遁丿丨:耍求

SN/T1193萎囚分析检测实验室技术要求

3术语和定义

阝

列术语和定义适川于本标准。

31

聚合酶链式反应polymerascchaInrcaction,PCR

DNΛ模板先经高温变性为单链,在适宜的温度卜和缓冲液中,两条引物分别与模板DNΛ两条链

L的一段IL补序列发FL迟火,接着在I)NΛ聚合酶的催化下以四种dN'ΓP为底物,使,Il火引物得以延

仲,如此反笈变性、迟火和延仲,使位于两段引物序列之问的DNΛ片段呈几何倍数扩增.

32

-聚

反转录合酶链式反应Ieversetranscriptionpol,merascchaIIlrcaC1it,n,R1-I’CR

RNΛ在逆转录酶的作用下,适宜反应条件下,被逆转隶成cI)NΛ,以cDNΛ作为模板进行PCR。

33

—

R1′PCRrea⒈“

实时荧光mefIuorescenceRT—PCR

实时荧光RTPCR方法是在常规RTPCR的基础上,加人一条特异性的荧光探针.该探针为

一段寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧

光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,T〃的5’3’夕卜切酶活性探针切,便光基团和

q酶将酶降解报告荧

淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可以接收到荧光信号,即每扩增-条DNΛ链,就有一个荧光分

子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物肜成完仝同步。

34

Ct值qc】ethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数.

4缩略语

j于.

F列缩略语适丹本标准

l

CB/T22287—2008

41HΛV:甲型肝炎病毒,

42TCID:0:组织培养半数感染量,是病毒感染一半组织细胞时的病毒稀f+·度,一般使用Reed

Muencb方。

法计算

5试剂

,所llJ试,规GB/T6682相

除有特殊说明外有实验剂均为分析纯;实验用水均为去离子水格符合关

规定。

51甘氨酸缓冲液:见附录Λ中的Λ11.

52PEG8000沉降液:见附录Λ中的A12,

53裂解液;Thzo⒈rcagcnt或其他等效产nll。

50P。ly(dt)磁珠:Dyndbcadsohgo(dt)25或萁他等效产品。

注:给出这一信虑是为了方便本标准使用者,并不表示对该产品的认可.如果其他等效产品具有相同的效果,则可

便川这些等效产品Ⅱ

551×RNA吸附缓冲液:见附录A中的A.2.5。

562XRNΛ吸附缓冲液:见附录A中的A.2.6。

57洗Λ2.7。

涤缓冲液:见附录Λ中的。

58QIΛamPⅥ洌RNAMiniKit(QIagensz9001)”

或其他等效产甜,

59suI)crscri【)tTMonc灬tcpItT—PCRwithplatinun1△aq(InvltrogcnCatNol0928031)Ⅱ或其他

.

等效产宀宀

…

510SupcrschⅡsrststrandsyhthes0systemforRT—I)CR(Invitr。gcnCatN。18080051)”或

其他等效产品。

5llUnivcrsalPCRMastcrMix(ABI4304437)D或其他等效产品。

512普RTPC次-3’)

歹(5′

逦测引牛勿刂

捡序

()Λ

]「义引牛勿(NoP1)CΛGCACATCΛΛΛGGTGAG

反义引物(NoP2〉CTCCAGAATCΛTCTCCAAC

引物位IHAV基囚组屮编码VP1-VP3壳蛋白的区域,目的片段长庋为192bp,

加尢RNasc的去离子水配制成100umol/L储各液。

513实时荧光RTPα检测的引物和探针

引物或探针序列(5’3’)

Jf义引物(HΛVl)TTTCCGGAGCCCCTCTTG

反义引物(HΛV2)AAΛGGGΛΛΛTTTΛGCCTΛrΛccc

反义氵丨物(HΛV3)ΛAΛGGGAΛΛATTTAGCCTATΛGCC

探针FΛNI-ΛCTTGATΛCCTCΛCCGCCGTTTGCCTTΛMRA

加无RNasc的去离子水配制成100umoVI'储备液。

514DNΛObp~20o0bp。

分子量标记:l。

51550×TΛE或其他等效缓冲液:兀附录A屮的Λ13。

51610XH样缓冲液:见附录Λ中的Λ16。

517甲肝减毒活疫苗:作为阳性对照添加于已知的阴性贝类样品中制成阳性质控样品。

518三叩烷:每次时注意防Rnasc污。

氯使用止染

519舁:每Rnasc污。

丙醇次侦用时注意防止染

D给出这一息是为了方便标准便用者,并不表/Tx对该产品的认叫.如果效品具l的果,则可

信本其他等产有相l。效

使川这些等效产品.

GB/T22287-2008

5⒛75%乙醇:见附录A中的Λ21。

521无RNasc的去离子水:见附隶A中的Λ23.

522溴化乙锭(l°ug/uL):见附录Λ中的A1亻.

523焦碳酸工乙酯.

6仪器与设备

61组织匀浆器(°r/min~⒛ooor/min).

62PCR仪(PE9600或其他等效设各)。

63实时荧光PCR仪(ΛBI7000或其他等效设备)。

64凝胶成像系统.

~9℃5

恒56温水浴℃01(。)

66涡旋混匀器(2°。r/mir1~2500r/min),

电76泳仪。~3)VVO0(0

68酸度计(0~1^0OpH,最小显示单位0°1pH,lmV)。

69高`b机

速冷冻离(Mcckmanml,ddJ221或其他等效设各).

~l0uL`2OuI'~100″

610微量加佯器(OluL~2ul'·1uI冫L,l00ul'~lO00uL,1000‘il'~

s000卩L)。

6ll超低温冰箱(-80℃)。

612带滤`b的无Rnasc的微量加样器吸头(lO`1I'd00uI',200uI'dmI')。

613无RNasc的离心倚和PCR反应管(20ul'd5mL,2mI',。

614磁力搅拌器.

615电子大:F(鼓小精庋值001g)。

7样品处理

71样品的运输与保存