GB/T 31795-2015 番茄黑环病毒检疫鉴定方法

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中人民和国国家标准

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GB/T31795-2015

番茄黑环病毒检疫鉴定方法

Detectionandide11tificatio11ofTomatoblackringvirits

2015-07-03发布2015-11-27实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

中国国家标准化管理委员会

GB/'f31795-2015

目lj~

本标准按照GB/T1.1-2009纷出的规则起草。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。

水标准起草单位：中华人民共和同上悔山入搅检验检疫局、中华人民共和罔天津山入境检验检疫

局、中华人民共和问北京Iii人搅检验检疫局。

本标准主要起草人：杨翠云、于君主、郭京泽、魏~东、邓丛良、乔艳艳、崔学慧、胡培龙、孙娟。

GB/'f31795-2015

番茄黑环病毒检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了番茄黑环病毒的DAS-ELISA、RT-PCR、免疫磁珠RT-PCR、实时荧光RT-PCR、鉴

别于守主检测和l免泣也锐等检疫鉴比方法。

本标准适用于植物材料，包括无性繁殖材料、种子和苗木巾番茄祟环病毒的检疫鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的J_ij_用是必水司少的。凡是注Fl期的引用文件．仅注门期的版水适用于本文

件。凡是不注目期的引用文件．其最那版本（包括所有的修改单〉适用于本文件。

SN/'f1840植物病毒免疫电镜检测方法

SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样

3仪器设备、设施、用具和试剂

3.1仪器设备

自每标仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工．作台、电子天平（感量0.001g）、电泳仪、电掠楠、凝胶成

像系统、电子透射显徽镜、1.Kr谷锅、高速冷冻离心机、超低温冰箱（－80℃〉、高压灭菌锅、制冰机、微i1主

炉、涡旋振荡部．

3.2设施

植物隔离检疫圃。

3.3用具

可如l式微旦；移液器（2i-tL、101..tL、1001..tL、200µL,10001..tL）及相应的无RNase吸头、无RNasei尚

心管、PCR管、研钵、样品袋、标签、银子、放大镜、磁力架等。

3.4主要试剂

除有特妹说明外，所有实验用拭齐IJ均为分析纯或生化试剂。

TBRV杭体、磁珠（具街走E顺磁憾的聚苯乙烯珠子．直径280nm.;i美丽标记.｛］41苯磺酷基）、Trizol、

焦般酸二乙醋（！）£PC）、液氮、＿：＿辄叫J；皖、异戊醉、异两jlj;jl、乙醉、八MY反转求捕、RNA陪抑制剂、Taq

DNA聚合酶、DNA分子标记、澳化乙健、琼脂糖、澳盼x｛等。

.irn.r古学和分子生物学检测试剂配制见附录’B。

4症状观察及抽样

4.1症状观察

现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为窑的症状‘TBRV为窑症状描述参见附录A。

CB/l'31795-2015

4.2抽样

发现有病毒为符症状的植物材料宦接法检；术发现症状的.li!IJ投SNIT2122rjr规定进行扣｜｜佯．并送

实验室检疫鉴定。

5检擅鉴定

5.1双抗体夹心酶联免疫吸附方法（DAS-ELISA)

对种苗、球茎或由种子催生长出的叶片研磨．并加入拙提缓冲液缸’1:10（质量：体积）的比例稀

释，制备的汁液分别盛装于离心管中，离心后吸取上清i在作为待测样品，并设阳性对照、阴性对照和空白

对照。具体操作步骤见附录C。

5.2Rl'-PCR方法

将来11苗、种球或和11子催生L~出的UI’片液氮研细．取0.1g用于提取植物总RNf＼.具体操作步骤见附

录D。

5.3免瘟磁珠R1'-PCR方法

首先进行免拔磁珠的分离．包括：清洗礁珠、抗体包被和抗原吸附．然后RT-PCR反应。只．体操作

步骤儿附录E。

5.4实时荧光R"f-PCR方法

将种苗、种球或种子催生长出的叶片液氮研细．取0.Jg用于提取植物总RN；.＼.具体操作步骤

见附录P。

5.5鉴别霉主测定方法

在栽种于植物隔离检疫圃中的鉴别寄主植物真叶长出后用于摩擦接种，对DAS-El,ISA或

RT-PCR检测’fBRV呈阳性的样品，加入适量接种缓冲液研磨后撞种鉴别寄主。当任意一种鉴别寄主

植物IL＼现如下描述症状时.~r1可判定接种成功：

a)屁谐黎（C'henoρdiu111q11i11oa）或克包黎（Chenoρdiu111a/f1ara11ticolυr）：接种日，.:J＼现局部褪绿

EE.然后出现系统褪绿斑驳。

b)黄瓜（Cucurnis拟tivu.s）：接利1日1·:JJ现局部褪绿斑或小型坏死环斑或黄斑，后出现系统环线脉，

畸形。

c)..Prince＂菜豆（Phaseolusvulgar-isvar.Pri11ce）：接种叶出现局部褪绿、坏死或畸形。

d)矮牵牛（Petuniahyhrida）：接种叶II＼现局部材斑或坏死环斑．然而出现系统褪绿环斑、钱纹或

明JI永．

e)番杏（Tetrag;oniae.:i·ρansa）：接科1日j-,LI＼现细轮纹，后IL\:f宠坏斑。

{)黄花烟（l\Jicotianarustica）：接种日十产生局部褪绿、坏死斑或环斑。

g)白肋烟（J\J.tabacu111Whiteburley）或三生烟（N.tabacurnSamsunNN)：接种叶产生局部：坏

死环和l斑点，系统斑点、环或者线条斑。

h)克利失兰炯（.N.cle·uelandii）：接种后接种叶产生局部环斑。

5.6免疫电镜方法

利用番茄黑环病毒抗血清富集植物材料中的病毒．在透视电子显微镜下观察病毒粒子的形态特征．

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GB/'f31795-2015

具体操作步骤按照SN/T1840规定进行。如观察到直径为28nm的球状病毒粒子大量聚集或者有被

抗体修饰的现象．即可判定免疫电镜结果阳性。

6结果判定

样品经fJAS-ELISA或者RT-PCR检测结果为阴性，判定该样品不携带番茄黑环病毒。

样1'fh经DAS-ELISA检测为阳性龟如果R下PCR或者免疫磁珠RT-PCR结果阳性．且序列测定结

果证实与所检测的番茄i黑；环病毒一敏；或轩经实时荧J(;.RT-PCR检ij!ljJ~阳性H才．可步ljJ.i:'样1'ii'J1凭借番刮i

黑环病毒。

样品经DAS-ELISA或者RT-PCR检测站＊为阳性，经免疫电镜观察到病毒颗粒或者接和J1鉴别幸好

主植物出现相应的症状时，可判定样品携带番茄黑环病毒。

7样晶保存与记录

7.1样品保存

经检测。确定携带番茄黑环病毒的样品，应妥善保存在适合的条件下以备复核。如利’子保存在干燥

室泪环境中；利’苗、鳞球茎等样品保存在一80℃冰箱中．做好登记和标记工作。

7.2记录

样品米源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检疫员的签字等。酶联免疫吸附测定法

检测应有酶联板反应的数值，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片．免疫电镜检测需要有电镜图片－

R下PCR和免疫磁珠R1'-PCR检测应有电泳囱及序列测定分析结果。实时荧光R'r-PCR检测需要有

荧光dll线图与Ct俏。

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附录A

（资料性附录）

番茄黑环病毒相关信息

A.1番茄黑环病毒基本信息

巾文名：番茄黑环病毒

学名：To111atoblackringvirus

缩写：TBR\T

分类地位：豆、l：豆花f.I十病毒科（Co111oviridae），钱虫传多面体病毒属（J\leρoviru..、）。

传播途径：闹土壤！由他钱虫长针线虫届（Lo川gidorussp.）传播．线虫介体只能短距离传播。TBRV

可在超过15个属的21种以上的植物中种传，通过种子和土壤随运输过程传播．被富多年生植物的繁殖

材料也可以传播病毒。

A.2方法原理

病毒粒子的形态特征、为将症状、J(JL消学特性和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒：的主要依据。采

用DAS-ELISA、RT-PCI＜.、免疫磁珠I<.T-I'CR、实时荧光RT-PCI＜.、免疫也镜和鉴别寄主反应等方法进

行番茄黑环病毒的检疫鉴定。

番茄黑环病毒有很多株系．所以异名较多：大豆环斑病毒Beauri略收οtviru川甜菜环斑病毒Beet

ringsρotviru.川芹菜黄脉病毒CeleryyellowM川1viru.s；高贯环斑病毒Let:tuceringsρotvirus；马铃薯

束状病毒Potatobouquetvirus；马铃薯伪奥肯巳病毒Potaloρseudο－aucubat时阳。具：巾.;lilt荣环斑病

毒的核二背酸序列l与TBR\T其他株系的核背酸序列差异较大．附录F的实时荧光RT-PCR方法不适合甜

菜环斑病毒的检测。

根据血宿学上的差异．番茄黑环病毒的株系主要属于两个血清型：苏格兰血清型（$）和德国血清型

<G）。S的l清理主要是离宦环斑株系和1马铃薯束状株系；G币1消型主要是甜菜环斑株系和i马铃薯伪奥

fijlj*?I：系。而芹菜茧脉株系则居于二者之间。

A.3生物学特性

A.3.1主要寄主

番册摆到；病沓的：寄：主也围很广．可以广泛侵染t(！于111－、双子H十的草本和水本fi!i物。包括Ai11需要的

经济作物，虫II葡萄和其他果树、甜菜、马铃薯和蔬菜〈葱屈、百It菜周、芸主屈、芮首脑、番茄属和菜豆腐的一

些利’）以及观赏植物，它还能侵染乔木和摇木以及一些杂草品种。

主要寄主包括：番茄（Lye《〉」＞e1siconesculentu.111）’韭葱CAlliu.111ροrγl/1川）．芹菜（Aρiu1r',/

gr

vulgaris).主4铃辑咱＜Sotαnu111tuberosu1n）.黄j瓦（Cu,·u1川issativus）.朝鲜西ij(Cynarascoly111u仆．肩1革柑

((Jlαdiolushybrids）.熙你CRubusj叩Iicosus）.摇盆子（Ru.busidaeus）.加子＜Solαruun111Plo11g仰α）．葡

萄（Vitisvi11ifera），黑穗醋栗（Rihesnigγll//'/).桃子（Prunusρersica).瑞典芫菁（Brassica11aρu.svar

/IQρobrassica).芜菁（Brassicαrapa），水fill(Narcissu.、Linn.）.洋葱（Alliu.111ceρω．甜搬CCa如icu111an-

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11uun1），草莓（Fragariaananassa），欧丁香（Syringavulgaris），金连翘＜Fo1乃11,hiai111er1nedia）等。

A.3.2野生寄主

野生：寄主包括：西洋接背水（Sa111bucu.snigra）.荠菜（Cαρsellabursα·ρastor），宝盖草（I，αIlliu111

a111ρLexicaule）等。

A.3.3受影晌的植物部分

3室株、nt·J「、果实／y号。

A.3.4为害症状

作物和杂草被害后很少有症状或无症状，但影响植物的生长。生长不良的植株在田间块状分布．而

且逐年扩展。通常早春症状比较明显．．而生伏旺季的夏季不明显。

TBRV为害被盆子（Rubusidaeus）时·．可造成不同栽珩品种的主1：覆盆子矮化、褪绿斑驳、环斑、叶片

卷曲或有果实变形易仰．产盘降低．当与葡盒子环斑病毒问AJ,LH现时．病悄加蓝．力［｜速植物死芒。

TBRV为害卫在部时，依据不同的栽捕；品种或年限，可导致草莓变色、