GB/T 31798-2015 油菜黑胫病菌检疫鉴定方法

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GB/T31798-2015

油菜黑腔病菌检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofPlenodomusbiglobosus

(Shoemaker&H.Brt1n)Gruyter,Aveskamp&Verkley

2015-07-03发布2015-11-27实施

中华人民共和国国家质量监督检验检痊总局

发布

中国国家标准化管理委员会

GB/1'31798-2015

目。吕

小；标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。

i11f注怠本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不欢扭识另lj这些专利的责任。

本标准由全国植物检疫标准化技术委员会＜SAC/TC271）提o'ttJf：归口。

本际准起草单位：’I•华人民共和国湖北出入境检验检疫局、'Irl叫树始检疫科学研究院、中华人民共

和同上梅山入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人挠检验检疫局、华中农业大a字。

＊标准丰~起草人：赵日军、王振华、曾宪东、易建平、李彬、李闽庆、央品珊、蔡翔。

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GB/'I'31798-2015

油菜黑腔病菌检疫鉴定方法

1范围

＊标准规定了油菜黑脏病菌（Plenodo1nusbiglobosus）的检疫鉴定方法。

本标准适用于油菜种子、植株及其产品中油菜黑脏病菌的检疫和鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3仪器设备和主要试剂

3.1仪器设备

生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成

像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋振荡器。

3.2主要试剂

除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682。

3.2.11%次氯酸制

3.2.2DNA提取试剂：DNA提取试剂盒．异丙醉，无水乙醉。尿素提取液（7mol/LUrea、50mmol/L

Tris-HC!pH8.0、62.5mmol/LNaCl、1%SDS），蛋白酶K(20mg/mL），苯酣：三氯甲烧：异戊醇

(25:24:1）榕液，3n1ol/LNaAc(pH5.2）。

3.2.3PCR试剂：10×PCR缓冲液（含25mmol/LMgSO.,),Taq酶，dNTPs。

3.2.4凝胶电泳试剂：琼脂糖.＇fAE.Loading缓冲液，EB。

3.2.520%V8培养基：V8蔬菜汁（CampbellSoup公司）200mL,CaC030.75g，琼脂粉13.0g，蒸恼

水定容至1000mL，调整pH至5.8,121℃高压灭菌20min.

3.2.6马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，氯霉素O.lg，琼脂13.0g，蒸

馆水定容至1000mL，调整pH至5.6,121℃高压，灭菌20min。

4病菌的鉴定

4.1症状检查

4.1.1种子症状检查

取样品最1%～5%C若样品少可适量增大比例）的种子，在解剖镜下挑选皱缩、干瘪、变色、残缺的

种子或有莓变的籽粒或病残体，每份种子样品挑选不少于500粒，用做病原菌的分离。另取Ikg利’子．

GB/'I'31798-2015

用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛，取筛J二物、筛下物和种子各1g～2g用于DNA提取。

4.1.2植株症状检查

取病变的植株的茎根部和ut部进行检查。主要检查茎根部和叶郁。选取叶片上出现圆形或不规则

形、稍凹陷、中音f~灰白色病斑、部分斑内散生许多小黑点症状的病变部位。植茎则选取不规则形淡褐色

斑，或灰白色病斑、稍凹陷、上生，黑色小点，或茎基及根系溃痛、枯萎症状的病变部位（参见附录A)o

4.2分离培养

4.2.1种子病原菌的分离培养

将挑选的疑带菌种子置于灭菌蒸倒水中室温浸泡处理ld，转入－20℃下冷冻处理1d,1%次氯

酸饷消毒5min~7min，无菌水洗涤3次后，用滤纸吸干种子，按25位Ilill置于VS培养基或PDA培养

基上．在20℃～25℃，12h黑暗／12h光照（12h光暗交替）条件下培养，第3天开始观察。

4.2.2植株病原菌的分离培养

用解剖刀取植株病健交界处的组织，剪成约0.4cm×0.4cm小段，用1%的次氯酸饷溶液消毒

5min.无菌水洗涤3次．灭菌滤纸吸干水分后置于VS脂培养基或PDA培养基上，同6.2.l培养观察。

4.3鉴定特征

该病菌在培养基上可良好生长，气生菌丝发达．产抱量大。后期（15d）可见到明显的抱子座和粉红

色的抱子溢出。气生菌丝量白色或微黄，后期菌丝上会分涩、I：~淡黄棕色的油状液滴。分生于包子呈长杆

形或梭形，长度在2.5µm~3.0µm之间，宽度在0.81.1m～1.11.1m之间。在抱子的两端各有一个透明的

小液滴。PDA培养基会随着菌丝的生长呈黑色或黄色。该病菌｜在PDA上产生黄褐色色素。

4.4PCR检测

4.4.1样晶DNA提取

取筛上物、筛下物和种子，或植株司疑病’变组织各1g~zg，液氮研磨后各取样0.1g~0.2g，采用

商业化试剂盒或尿素法提取DNA（参见附录白。

4.4.2PCR检测方法

PCR检测方法参见附录C，重复3次。用油菜黑脏病菌（Plen.biglobosiis）参p~菌株DNA作阳性

对照，用灭菌蒸馆水作空白对照。

5结果判定

病菌的分离培养形态特