GBZ/T(卫生) 240.11-2011 化学品毒理学评价程序和试验方法 第11部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验

ICS13.100

C52

中华人民共和国国家职业卫生标准

/—

GBZT240.112011

化学品毒理学评价程序和试验方法

:

第部分体内哺乳动物骨髓嗜多染红

11

ㅤㅤㅤㅤ

细胞微核试验

—

Proceduresandtestsfortoxicoloicalevaluationsofchemicals

g

:

Part11Invivomammalianerthroctemicronucleustest

yy

2011-08-19发布2012-03-01实施

中华人民共和国卫生部发布

/—

GBZT240.112011

化学品毒理学评价程序和试验方法

:

第部分体内哺乳动物骨髓嗜多染红

11

细胞微核试验

1范围

/、、、

GBZT240的本部分规定了哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验的目的试验概述试验方法数

、。

据处理与结果评价评价报告和结果解释

本部分适用于检测化学品的致突变作用。

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅所注日期的版本适用于本

。,()。

文件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/职业卫生名词术语

GBZT224

/:

化学品毒理学评价程序和试验方法第部分总则

GBZT240.11

3术语和定义ㅤㅤㅤㅤ

/界定的术语和定义适用于本文件。

GBZT240.1

3.1

微核micronucleus

,

在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时仍然滞留在细胞质中的染色单

,。,或几

体或染色体的无着丝点断片或因纺锤体受损而丢失的整条染色体它在末期以后单独形成一个

,,,。

个规则的次核被包含在子细胞的胞质内而形成因比主核小故称为微核

3.2

着丝粒/

centromerekinetochore

,。

细胞分裂中期染色体上纺锤丝附着的区域借此子代染色体得以有规律地向子代细胞两极移动

3.3

正染红细胞,

normochromaticerthrocteNCE

yy

核糖体已消失的成熟红细胞。

3.4

嗜多染红细胞,

olchromaticerthroctePCE

pyyy

细胞质内仍含有核糖体的未成熟红细胞。

4试验目的

检测受试样品是否能引起哺乳动物骨髓嗜多染红细胞染色体或有丝分裂器损伤而诱导含微核细胞

,。

发生率增高以评价受试样品致突变的可能性

1

/—

GBZT240.112011

5试验概述

,,,,、、

通过适当的途径使动物接触受试样品一定时间后处死动物取出骨髓制备涂片经固定染色在

显微镜下计数含微核的嗜多染红细胞。

6试验方法

6.1试剂

()

6.1.1小牛血清灭活

。

小牛血清滤菌后置于56℃恒温水浴保温30min进行灭活灭活的小牛血清通常贮存于4℃冰箱

。、。

里亦可用大鼠小鼠血清代替

6.1.2姬姆萨()染液

Giemsa

染料

Giemsa3.8g

甲醇375mL

甘油125mL

:,,,

配制将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨再加入甲醇至375mL待完全溶解后再加

,。。,。

入125mL甘油混合均匀置37℃恒温箱中保温48h保温期间振摇数次促使染料的充分溶解取

,。

出过滤两周后使用

ㅤㅤㅤㅤ

6.1.3磷酸盐缓冲液(H6.8)

p

//:()。

115molL磷酸氢二钠溶液磷酸氢二钠NaHPO9.47g溶于1000mL蒸馏水中

24

//:()。

115molL磷酸二氢钾溶液磷酸二氢钾KHPO49.07g溶于1000mL蒸馏水中

24

取//磷酸氢二钠溶液与//磷酸二氢钾溶液混合。

115molL50mL115molL50mL

6.1.4Giemsa应用液

//。。

取份染液与份磷酸盐缓冲液混合而成临用时配制

1Giemsa9115molL

()

6.1.5甲醇分析纯

,,。

全部试剂除注明外均为分析纯试验用水为蒸馏水

6.2受试样品处理

、、、、。,

通常用蒸馏水等渗盐水植物油食用淀粉羧甲基纤维素钠等如使用特殊溶剂或载体应有参

考资料说明其成分。

6.3实验动物

常规选用成年的健康小鼠或大鼠。

6.4剂量设计

,。/

至少设置三个剂量组高剂量组应达到不产生动物死亡的最大毒作用剂量一般取受试样品12

/,。大于/体

或低于的剂量以求获得微核的剂量反应关系曲线当受试样品的LD5k

LD5012LD50-50gg

2

/—

GBZT240.112011

,/,,、,

重时可取体重为高剂量每个剂量组只动物雌性雄性各半同时应设阳性对照和阴性对

5k10

gg

。,。

照阳性对照物应能引起骨髓嗜多染红细胞微核率明显高于背景资料染毒途径可以不同于受试样品

,:

所选用的阳性对照物最好与受试样品类别有关常使用的阳性对照物有

———环磷酰胺(,号);

cclohoshamideCAS50-18-0

ypp

———甲磺酸乙酯(,号);

ethlmethanesulhonateCAS62-50-0

yp

———乙基亚硝基脲(,号);

ethlnitrosoureaCAS759-73-9

y

———丝裂霉素(,号);

CmitomcinCCAS50-07-7

y

———(,)。

三亚乙基嘧胺号等

triethlenemelamineCAS51-18-3

y

如使用特殊溶剂的应设溶剂对照。

6.5试验步骤

6.5.1染毒

。

骨髓PCE微核试验要求给受试样品后短期内能在骨髓达到有效浓度常用的方式是腹腔给药及

经。,,

口给药由于受试样品的理化性状各不相同经各种途径给药后吸收速度及分布也有差异故可按实

,。,。,

际需要选用合适的给药途径染毒途径视试验目的而定宜采用经口灌胃方式采用一次给药于

;,,

24h~48h之间取材还可采用30h两次给药法即两次给药间隔24h第二次给受试样品后6h

取材。

6.5.2取材

,,,,,

颈椎脱臼处死动物后打开胸腔沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断剥掉附着其上的肌肉擦净血污

,,ㅤㅤㅤㅤ。

横向剪开胸骨暴露骨髓腔然后用止血钳挤出骨髓液

6.5.3标本片制备

6.5.3.1骨髓涂片

,。,

将骨髓液滴在载玻片一端的小牛血清液滴里仔细混匀一般来讲两节胸骨髓液涂一张玻片为

。,,。在空气中晾干。

宜然后按血常规涂片法涂片长度约2cm~3cm

6.5.3.2固定

。,。

将干燥的涂片放入甲醇液中固定5min~10min即使当日不染色也应固定后保存

6.5.3.3染色

。,。

将固定过的涂片放入Giemsa应用液中染色10min~15min立即用蒸馏水冲洗晾干

6.5.3.4封片

,,

待染片完全干燥后或用滤纸及时擦干染片背面的水滴再用双层滤纸轻轻按压染片以吸附染片上

,,,,

残留的水分再在空气中晃动数次以促其尽快晾干然后放入二甲苯中透明5min取出滴上适量光学

,,。

树胶盖上盖玻片写好标志

6.5.4镜检

。,。

6.5.4.1本法观察含微核的嗜多染红细胞嗜多染红细胞呈灰蓝色成熟红细胞呈淡桔红色微核大

,,,。,

多数呈单个圆形边缘光滑整齐嗜色性与核质相一致呈紫红色或蓝紫色选择细胞分布均匀细胞无

,,。,

损着色适当的区域再在油镜下计数虽然不计数含微核的有核细胞但需用有核细胞形态染色是否

/—1

GBZT240.1120111

0

—

2

正常作为判断制片优劣的标准。

,(1

6.5.4.2应对每个动物的骨髓至少观察200个红细胞计数嗜多染红细胞在红细胞总数嗜多染红细1.

),。/

胞嗜正染红细胞中比例时嗜多染红细胞在红细胞总数中比例不应低于对照值的如果

+20%PCE0

4

,,,,。

NCE<0.1说明红细胞生成过程受到抑制试验结果不可靠应重新设计剂量进行试验2

/

T

。,

6.5.4.3每只动物至少计数1000个嗜多染红细胞微核率指含有微核的嗜多染红细胞数以千分率

()。,。Z

‰表示若一个嗜多染红细胞中出现两个以上微核仍按一个有微核细胞计数并应计算正常红细B

胞和嗜多染红细胞的比例。G

7数据处理与结果评价

,,

计算各组微核细胞率的均数和标准差用适当的统计学方法对受试样品各剂量组与溶剂对照组的

。,,

微核率进行比较如果受试样品剂量组与对照组相比统计学上有显著性差异并有剂量反应关系则

-

可认为微核试验阳性。

8评价报告

/,:

除GBZT240.1规定的一般项目外评价报告还应包括以下内容

):、;

a受试样品配制方法所用溶剂及其对受试样品的溶解性和稳定性

):、、、、、()、、;

b动物种属品系体重数量性别来源注明合格证号和动物级别喂养条件饲料等

):、、、;

c实验动物饲养环境饲料来源室温相对湿度实验动物室合格证号

):、、ㅤㅤㅤㅤ、;

d试验方法选定剂量依据剂量换算染毒途径和方式试验处理与制片过程

):、;

e毒性评价分析每只动物细胞数试验干扰因素及评价方法等

)以列表方式报告受试样品对动物骨髓细胞微核发生率;

f

g)结论。

9结果解释

。

阳性结果表明受试样品在本试验条件下可引起哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核率增加阴性结果

表明在本试验条件下受试样品不引起哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核率增加。