GBZ/T(卫生) 240.28-2011 化学品毒理学评价程序和试验方法 第28部分：慢性毒性/致癌性联合试验

ICS13.100

C52

中华人民共和国国家职业卫生标准

/—

GBZT240.282011

化学品毒理学评价程序和试验方法

:/

第部分慢性毒性致癌性联合试验

28

ㅤㅤㅤㅤ

—

Proceduresandtestsfortoxicoloicalevaluationsofchemicals

g

:/carcinoenicittest

Part28Combinedchronictoxicitgy

y

2011-08-19发布2012-03-01实施

中华人民共和国卫生部发布

/—

GBZT240.282011

化学品毒理学评价程序和试验方法

:/

第部分慢性毒性致癌性联合试验

28

1范围

/、、、

GBZT240的本部分规定了动物慢性毒性和致癌性合并试验的目的试验概述试验方法数据处

、。

理与结果评价评价报告和结果解释

本部分适用于同时检测化学品的慢性毒性和致癌性。

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅所注日期的版本适用于本

。,()。

文件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/职业卫生名词术语

GBZT224

/:

化学品毒理学评价程序和试验方法第部分总则

GBZT240.11

3术语和定义

ㅤㅤㅤㅤ

/、/界定的术语和定义适用于本文件。

GBZT240.1GBZT224

4试验目的

(、),()

通过一定途径经口经皮或吸入动物在正常生命期的大部分时间内反复接触不同剂量浓度的

,,(),

受试化学品观察实验动物主要的慢性毒性效应确定无可见有害作用水平浓度同时观察化学品对

,,。

实验动物的致癌作用求出剂量效应关系为拟定人类接触该化学品的职业接触限值提供参考依据

-

5试验概述

,,

在实验动物的大部分生命期间将受试化学物质以一定方式染毒观察动物的中毒表现并进行生化

、、,;

指标血液学指标病理组织学等检查以阐明此化学物质的慢性毒性观察动物的大部分或整个生命期

、、,

间及死后检查肿瘤出现的数量类型发生部位及发生时间与对照动物相比以阐明此化学物质有无致

。、,。

癌性本试验设计需得当试验过程需合理可同时检测受试样品的致癌性和主要的慢性毒性

6试验方法

6.1受试样品

6.1.1资料收集

,。

在开始本试验之前应尽量收集受试样品现有的各种资料

)();

a受试样品的商品名和其他名称包括CAS号

1

/—

GBZT240.282011

)、;

b受试样品的结构式分子式和相对分子质量

)、(:、、、、、、、

c受试样品的物理化学性质可包括外观沸点熔点密度折射率光谱资料溶解度挥发

、、/3、、、)。

性化学活性和换算系数光化学性质电离度粒度等重要的参数还包括稳

mmm

ppg

();

定性包括在介质或饲料中的稳定性

)、;

d受试样品的成分主要杂质

)、;

e受试样品的生产方法合成路线

):()。

f储存方法要有长期储存受试样品包括在介质或饲料中的合适方法否则需定期制备新鲜

样品;

)人类可能接触的途径和水平。

g

6.1.2登记接受样品的日期

。,

开始试验前应有适当数量的受试样品样品来源和批号应相同尽可能使用同一批生产的受试样

,,。

品否则分别测定每一批受试样品的纯度和杂质

6.2实验动物和饲养环境

6.2.1动物种系的选择

、。

可根据急性亚慢性毒性试验和毒物代谢动力学试验资料选择合适的动物种系致癌试验通常选

,,,,

择小鼠或大鼠而慢性毒性试验通常选用大鼠或狗因此选用大鼠作本试验较为理想但也不排除选用

,,,

其他动物种系的可能性总之应尽可能选择对致癌性和慢性毒性敏感而自发肿瘤发生率又较低的

动物。

ㅤㅤㅤㅤ

6.2.2动物性别和年龄

应使用两种性别的动物。

,

通常使用刚断奶或断奶不久的年幼动物来进行试验尽量使动物在其生命期内有更长的时间接触

。,,

受试样品和诱发肿瘤有时候甚至采用在母体宫内便开始接触受试样品在脏器形成期部分组织器官

如神经组织对致癌物敏感。

,。

啮齿类动物断奶和适应环境之后要尽快开始试验最好在周龄之前如作宫内染毒或在哺乳期

6

染毒则需特别设计。

6.2.3实验动物数

,,

为了最大限度保证试验结果的可靠性和满足统计学处理动物应随机分成试验组和对照组而且每

,。

组都应有相当多的动物数保证试验结束时有足够的动物进行详细的生物学和统计学分析

;,

每一剂量组和对照组至少应有只雄性和只雌性的动物如果需要提前剖杀部分动物应适当

5050

。,,。

增加数量如设附加组高剂量组还应增加雌雄动物各只对照组增加雌雄动物各只

2010

、

6.2.4动物的管理饲料和饮水

,

6.2.4.1实验动物和动物试验的环境设施应符合国家相应规定至少应使用清洁级动物设施进行试

。,。、、、

验必须有合理的动物管理措施并严格控制环境条件尽量减少人员流动饲养条件疾病药物治疗

、、、。

饲料的杂质空气饮水垫料等都可能对试验结果产生影响

,。

6.2.4.2至少应使用清洁级动物进行试验购入动物需经检疫方能用于试验每一房间只能饲养一种

;,。

动物每一房间只供一种受试样品试验用还应避免受试样品对对照组动物的影响

,,

6.2.4.3笼具等物品应便于消毒和清洁应避免使用消毒剂和农药等特别是与动物有密切接触的部

2

/—

GBZT240.282011

,。

位更应注意因为这类物质对试验结果可能产生影响

,(),

6.2.4.4饲料应满足动物营养需要应定期分析饲料成分包括营养成分和杂质等不含对试验有影

,(、、)

响的杂质或含有的杂质成分不超过标准目前已明确某些物质如抗氧化剂不饱和脂肪酸硒等对致

,、、、、。

癌试验有影响而有些物质如农药残留氯烃多环芳烃雌激素重金属等等对试验有影响饲料成分

分析结果应在评价报告中列出。

,。

6.2.4.5如果受试样品掺在饲料或饮水中染毒应测定受试样品在饲料或饮水中的稳定性和均匀性

,,

6.2.4.6如果受试样品的毒性较低则加入饲料的受试样品比例较大应注意混入饲料中的受试样品

,。

浓度不应超过5%否则会对动物正常营养产生影响

。,。

6.2.4.7必要时对饮水中的污染物也应监测食盒内饲料应定期更换每周至少一次动物自由

饮水。

6.3试验分组

。,

至少要设三个剂量组及一个对照组高剂量组可以出现较轻的毒性反应如血清酶水平改变或体

重减(),。,

轻等减少程度不多于10%但不能明显缩短动物寿命低剂量不能引起任何毒性反应应不影

、,。中剂量应介于高剂量和低剂量

响动物的正常生长发育和寿命其剂量一般不应低于高剂量的10%

之间。

,,

以上剂量的选择应根据现有资料制定最好能根据亚慢性毒性试验资料如有代谢动力学资料

更好。

,。

高剂量组和对照组应设附加组以观察受试样品的慢性毒性作用的恢复过程

,。

通常每天均应染毒但根据染毒途径可有不同受试样品加入饲料或饮水中进行经口试验时可连

。。

续染毒染毒频率可根据毒物代谢动力学资料而调整

ㅤㅤㅤㅤ

。,。

应设立对照组对照组动物不接触受试样品及其他介质其他处理均与染毒组相同若需对溶剂

,,,

或添加剂染毒应加入溶剂或添加剂这些溶剂或添加剂不应影响受试样品的吸收或引起毒性作用同

时还应设相应的溶剂或添加剂对照组。

6.4染毒途径

6.4.1经口

,。,

如果受试样品可通过胃肠道吸收最好选用经口途径可将受试样品混入饲料或饮水中喂饲每周

;,,。

染毒也可采用灌胃最好是每周染毒每周灌胃也是可以接受的但染毒停顿可使动物得

7d7d5d

,。

到恢复会影响结果及最后的评价

6.4.2经皮

,。

皮肤接触方式可能是用于人类接触该化学品的一个主要途径可作为诱发皮肤病变的试验模型

,。/()。

最好每周染毒7d也可每周染毒5d具体染毒方法参照GBZT240.25慢性经皮

6.4.3经呼吸道吸入

6.4.3.1染毒时间

,();,

按职业接触方式是每天6h每周5d称间歇暴露方式按环境污染物接触方式为每天23h留下

,()。

约1h给动物喂食和清理染毒柜每周7d称连续暴露方式染毒时间从染毒柜达到预定浓度开始计

。,。

算无论那种暴露方式浓度都要求恒定动物在这两种暴露方式中的主要不同是间歇暴露的动物每

,。

天有17h~18h恢复而且在周末恢复时间更长

。,

染毒方式取决于试验设计和人类主要的接触方式虽然连续暴露方式能够模仿环境暴露条件但

3

/—

GBZT240.282011

,、、。

对设备的要求更高如提供饮水和饲料设置气溶胶发生装置浓度监测装置等间歇暴露方式的染毒

,()。

柜要求较低且在染毒过程可不必提供饮水和饲料最好能提供饮水

6.4.3.2染毒柜

//;;

染毒柜的设计应保证换气次数能达到次次柜内氧含量左右柜内受试样品浓度

12h~15h19%

;;,

均匀对照组与浓度组动物用柜的设计完全一致应保证笼内动物不太拥挤使动物能最大限度接触受

;;,。

试样品动物所占体积不超过染毒柜体积的5%染毒柜应保持一定的负压以防受试样品意外漏出

6.4.3.3物理参数监测

物理参数的监测项目及要求如下:

———,:

必须连续监测保证管道通畅以及各个染毒柜条件相同

———:;

空气流量需连续监测

———:;

柜内受试样品浓度尽量保持恒定

———:,(),

柜内温湿度温度22℃±2℃湿度30%~70%以水为载体的受试样品染毒时除外应连续

监测;

———:,。

粒径大小粒子应是可吸入大小在动物呼吸带采样检测在气溶胶发生装置调试时要多做检

,。

测稳定后可定期检测

6.5染毒周期

/,,

慢性试验致癌试验应尽量覆盖动物的生命期曾有建议致癌试验应终生染毒但考虑到部分动物

,ㅤㅤㅤㅤ,。,

的寿命比平均寿命长许多如果到全部动物死亡才结束则试验可能不必要地拖长因此在动物寿命

,,。

大部分的时间染毒即可因为绝大多数化学品如果有致癌性的话在这段时间应可出现

,。

小鼠和仓鼠通常染毒个月大鼠通常为个月如果选用的动物种系寿命较长或动物自发肿

1824

,,。

瘤发生率较低如小鼠和仓鼠应染毒个月大鼠个月

2430

,。,

如果最低剂量或对照组动物存活率只有25%时可以结束试验如两性别有明显差异应将雌雄

,。

性动物的试验视为两个试验其结束的时间也可不同个别情况下因受试样品毒性明显而造成高剂量

,。

组动物过早死亡此时不应结束试验

(),

如需提前剖杀动物至少包括高剂量组雌雄各只和对照组雌雄各只至少应该染毒个月

201012

。,。

以上其资料用于评价和受试样品有关的慢性毒性作用但并非因老年性改变所导致的病理改变

动物损失在任何一组都不能高于10%。

6.6临床观察

。,

6.6.1试验期内每天应至少详细观察一次必要时还应增加观察次数并采取适当措施减少动物损

,,、、,

失如对死亡动物进行解剖对质弱或濒死动物隔离处死冷藏并剖验并仔细记录毒性作用的开始时

间及其进展情况。

,,、

6.6.2应记录所有动物临床表现和死亡情况特别应注意肿瘤的发生和发展如肿瘤出现的时间部

、、。

位大小外观和进展情况

,,。

逐个记录体重变化前周每周记录一次此后每周记录一次摄食量在前周每周记录

6.6.313413

,。,

一次此后如动物健康状况或体重无异常改变则至少一个月记录一次经饮水染毒时应记录饮水量以

便计算受试样品摄入量。

,,,

6.6.4建议在动物染毒前和染毒后最好对所有实验动物至少应对高剂量组和对照组动物使用眼科

。。

镜或其他有关设备进行眼科检查若发现动物有眼科变化则应对所有动物进行检查

4

/—

GBZT240.282011

6.7临床检查

6.7.1血常规检查和其他血液指标检查

、、、、、

检查指标可包括血红蛋白浓度红细胞压积红细胞数血小板数白细胞计数与分类凝血功能等

。(,

指标在染毒开始后第个月和第个月各检查一次如果没有该种动物品系的历史资料时可在试验

36

),,。,

开始时做正常值此后每隔约个月检查一次试验结束时检查一次大鼠每组每性别可检查只

610

。。

非啮齿类动物应全部检查每次检查的动物最好相同

,。

在试验过程中如有动物健康状况恶化对该动物作白细胞分类计数白细胞分类计数通常先在高

,。

剂量组和对照组进行如高剂量组有问题才依次再检查较低剂量组动物

6.7.2尿液检查

,,,

收集各组动物尿样进行分析大鼠每组每性别可检查只非啮齿类动物应全部检查每次检查的

10

,。

动物最好相同检查时间间隔与血常规检查一致

尿液的常规检查包括外观、、、。

pH值尿蛋白尿糖和血细胞如尿样分析可作为预期或观察得到的

,。

毒性指标则可增加有关的尿液检查项目

6.7.3临床生化检查

,,

在染毒开始后第个月和第个月各检查一次此后每隔约个月检查一次试验结束时检查一

366

。,。。

次大鼠每组每性别可检查只非啮齿类动物应全部检查每次检查的动物最好相同

10

()、()、()、

检查指标主要包括丙氨酸氨基转移酶ALT天门冬氨酸氨基转移酶AST尿素氮BUN肌酐

()、()、()。、()、()、()、()、

Cr白蛋白Alb总蛋白TP如有必要还应做电解质平衡钙Ca磷P氯Cl钠Na钾

ㅤㅤㅤㅤ

()、()()、()。,

K空腹血糖Glu禁食时间要适当碱性磷酸酶ALP与总胆红素在某些情况下还须检测与肝

,、、、()。

或其他器官有关的酶和胆酸以及脂类化合物激素高铁血红蛋白胆碱酯酶ChE活性等分析如出

,。

现肉眼可见的脏器改变可增加与之相应的血液生化指标还可增加其他脏器以进一步对观察到的毒

性反应进行研究。

6.7.4眼科检查

,,,

建议在动物染毒前和染毒后对所有实验动物至少应对高剂量组和对照组动物使用眼科镜或其

。。

他有关设备进行眼科检查若发现动物有眼科变化则应对所有动物进行检查

6.7.5大体解剖

,。,

所有动物包括在试验过程中死亡或濒死而被处死的动物均应进行大体解剖如果处死动物处死

。、。

前应收集其血样进行白细胞分类计数保存所有肉眼可见病变肿瘤或可疑肿瘤组织应分析大体解

剖与病理组织学检查结果的对应情况。

。:、、()、、

所有的器官组织都应保存一般包括下列器官和组织脑垂体甲状腺包括甲状旁腺胸腺肺

()、、、、、、、、、、、、、、、、

包括气管心脏主动脉唾液腺肝脾肾肾上腺食管胃十二指肠空肠回肠盲肠结肠直肠

、、、、、、、、、、(,,)、

子宫膀胱淋巴结胰腺性腺生殖附属器官雌性乳腺皮肤肌肉外周神经脊髓颈胸腰段胸

()。。,

骨或股骨包括关节和眼睛肺和膀胱用固定剂填充能保存更好在吸入试验整个呼吸系统的组织

、。、、、、、,,

器官包括鼻咽喉等均应检查脑肝脾肾肾上腺性腺需称重大鼠每组每性别可称只非啮齿

10

类动物还应包括甲状腺及甲状旁腺。

6.7.6病理组织学检查

,、。

6.7.6.1应详细描述病变情况特别是增生癌前病变和癌变情况

5

/—

GBZT240.282011

6.7.6.2对所有肉眼可见的肿瘤和异常的组织器官应进行病理组织学检查。

、

6.7.6.3对在试验中途死亡或处死的动物所有高剂量组和对照组动物的组织器官进行病理组织学检

查并详细描述。

,

6.7.6.4试验结果证明某一剂量组的动物正常寿命发生明显改变或诱发了影响毒性反应的效应则下

一个剂量组也应做病理组织学检查。

,

6.7.6.5如果怀疑某种病变是由受试样品引起的则应对所有剂量组动物的相应器官和组织进行病理

组织学检查。

,。

6.7.6.6某一剂量组病理组织学检查有问题时下一剂量组需作病理组织学检查

,

6.7.6.7如高剂量组与对照组病理组织学检查存在明显差别则其他剂量组的相应器官和组织也应进

行病理组织学检查。

()。

6.7.6.8需参考受试动物自发病变的资料如相同试验条件下的历史资料

7数据处理与结果评价

7.1数据处理

。,

可通过表格形式总结试验结果对所有数据应采用适当的统计学方法进行评价统计学方法应在

试验设计时确定。

,。

试验组与对照组动物的平均寿命要基本相同如果差别较大将会影响试验结果的可靠性因肿瘤

,,。

发生率和动物寿命关系极大统计分析试验结果时应列出各组动物的平均寿命

7.2结果评价

ㅤㅤㅤㅤ

7.2.1慢性毒性的评价

,。

应结合前期试验结果并考虑到毒性效应指标和解剖及病理组织学检查结果进行综合评价毒性

、。

评价应包括受试样品染毒剂量与是否出现毒性反应毒性反应的发生率及其程度之间的关系这些反

、、、、

应包括行为或临床异常肉眼可见的损伤靶器官体重变化情况死亡效应以及其他一般或特殊的毒性

。。

作用成功的慢性试验应能够提出在安全性评价中有意义的NOAEL

7.2.2致癌性评价

7.2.2.1肿瘤发生率:

。

肿瘤发生率是整个试验终结时患肿瘤动物数在有效动物总数中所占的百分率有效动物总数指最

早出现肿瘤时的存活动物总数。

试验终结时患瘤动物总数

肿瘤发生率=×100%

有效动物总数

7.2.2.2在分析受试样品致癌性时应注意:

)不常见的肿瘤类型;

a

)在多个部位发生肿瘤;

b

)不同染毒途经均诱发肿瘤;

c

)在不同种系动物或两性别动物均诱发肿瘤;

d

)从癌前病变到癌变的进展情况;

e

)癌前病变的潜伏期缩短;

f

)转移;

g

)肿瘤异常增大或增多;

h

6

/—

GBZT240.282011

)恶性肿瘤的比例;

i

)剂量效应关系显著。

j-

7.2.2.3致癌试验阳性的判断标准:

,

试验组与对照组之间的数据经统计学处理后以下任何一项有显著性差异即可认为受试样品的致

癌作用为阳性:

———,;

肿瘤只发生在剂量组动物中对照组无该类型肿瘤

———,;

剂量组与对照组动物均发生肿瘤但剂量组发生率明显增高

———,;

剂量组动物中多发性肿瘤明显对照组中无多发性或只少数动物有多发性肿瘤

———,。

剂量组与对照组动物肿瘤的发生率无显著性差异但剂量组中肿瘤发生的时间较早

,,,

必须指出染毒组和对照组肿瘤发生率差别不明显但癌前病变差别显著时不能轻易否定受试样

品的致癌性。

,,

另外自发性肿瘤一般只出现于生命较晚和好发于内分泌腺或与内分泌功能有密切联系的组织如

、、。

垂体肾上腺睾丸及乳腺等

,,(),,

在试验中两个性别个剂量水平其中一个接近最大耐受剂量每组动物数至少只试验组

350

,。

肿瘤发生率与对照组无差异时可判定本试验结果为致癌阴性

8评价报告

/,:

除GBZT240.1规定的一般项目外评价报告还应包括以下内容

)肿瘤发生的时间及其发展情况;

a

)眼科检查结果;

b

ㅤㅤㅤㅤ

),;

c按性别和剂量的大体解剖和组织病理学检查说明肉眼可见和镜检病变的性质

)病理组织学检查所见的详细描述;

d

)、、;

e慢性毒性表现靶器官NOAEL

)