GBZ/T(卫生) 240.8-2011 化学品毒理学评价程序和试验方法 第8部分：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验

ICS13.100

C52

中华人民共和国国家职业卫生标准

/—

GBZT240.82011

化学品毒理学评价程序和试验方法

:

第部分鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验

8

ㅤㅤㅤㅤ

—

Proceduresandtestsfortoxicoloicalevaluationsofchemicals

g

:

Part8Salmonellathimuriumreversemutationassa

ypy

2011-08-19发布2012-03-01实施

中华人民共和国卫生部发布

/—

GBZT240.82011

化学品毒理学评价程序和试验方法

:

第部分鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验

8

1范围

/()、、

GBZT240的本部分规定了鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验Ames试验的试验目的试验概述试

、、。

验方法结果评价评价报告和结果解释

()。

本部分适用于检测化学品有杀菌作用的除外的致突变性

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅所注日期的版本适用于本

。,()。

文件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/职业卫生名词术语

GBZT224

/:

化学品毒理学评价程序和试验方法第部分总则

GBZT240.11

3术语和定义

ㅤㅤㅤㅤ

/界定的术语和定义适用于本文件。

GBZT240.1

3.1

回复突变reversemutation

细菌由营养缺陷型回变到野生型。

3.2

鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验salmonellathimuriumreversemutationassa

ypy

,

利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株测定化学品引起沙门氏菌碱基置换或移码突变所

诱发的组氨酸缺陷型(-)回变到野生型(+)的试验方法。

hishis

4试验目的

,。

检测化学品的诱变性预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性

5试验概述

,,

鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸故在缺乏组氨酸的培养基上仅有少数自发

。,,

回复突变的细菌生长假如有致突变物存在则营养缺陷型的细菌回复突变成野生型因此能生长形成

,。

菌落据此判断受试样品是否为致突变物

,,。

某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变故需加入外源性代谢活化系统如S

9

1

/—

GBZT240.82011

6试验方法

6.1受试样品处理

,。,

选定受试样品的合适溶剂首选无菌水作为溶剂如果不溶于水的或水溶性低的化学品可选二甲

基亚砜。

6.2剂量设计

。,

决定受试样品高剂量的标准是对细菌的毒性及其溶解度自发回变数的减少背景变得清晰或被

,。,

处理的培养物细菌存活数减少都是毒性的标志每一受试样品检测时至少设五个剂量组剂量设定范

//,。

围为5μg皿~5000μg皿也可根据预试验结果按等比组距设定检测的剂量范围

6.3试验方法

6.3.1配制培养基和试剂

6.3.1.120%葡萄糖溶液

,,。贮于冰箱。

称取200g葡萄糖加入蒸馏水至1000mL0.055MPa高压灭菌20min4℃

/组氨酸/生物素溶液成分

6.3.1.20.5mmolL-0.5mmolL

()

生物素相对分子质量

D-244122mg

()

组氨酸相对分子质量

L-15578m

ㅤㅤㅤㅤ

g

无菌蒸馏水至1000mL

,。。

不宜进行高压灭菌处理使用无菌玻璃器皿配制贮于4℃冰箱

6.3.1.3代谢活化系统

,。

大鼠肝微粒体酶S其诱导和制备方法见附录A

6.3.1.4盐溶液(//)成分

1.65molLKCl-0.4molLMCl

g2

氯化钾()

KCl61.5g

氯化镁(·)

MCl6HO40.7

g22g

蒸馏水至500mL

0.103MPa高压灭菌30min。贮于4℃冰箱。

/磷酸盐缓冲液()成分

6.3.1.50.2molLpH7.4

磷酸二氢钠(·)

NaHPO2HO2.965g

242

磷酸氢二钠(·)

NaHPO12HO29.015g

242

蒸馏水至500mL

0.103MPa高压灭菌30min。贮于4℃冰箱。

6.3.1.60.15mo/氯化钾溶液

lL

称取氯化钾,,。。

11.18g用蒸馏水稀释至1000mL0.103MPa高压灭菌30min贮于4℃冰箱

2

/—

GBZT240.82011

氨苄青霉素碱性溶液(/)

6.3.1.78mmL

g

,/。

称取氨苄青霉素80mg加入0.02molLNaOH溶液10mL

6.3.1.80.1%结晶紫溶液

,。

称取结晶紫10mg加10mL无菌水

四环素溶液(/)

6.3.1.98mmL

g

,/。

称取四环素40mg加入0.02molLHCl溶液5mL

:、()。

6.3.1.10溶解或稀释化学物质常用溶剂蒸馏水二甲基亚砜DMSO

(—):

6.3.1.11常用阳性对照及参考剂量参见GB15193.42003

柔毛霉素()/皿

Pubescens6.0μg

叠氮化钠()/皿

NaN1.5g

3μ

氨基芴()/皿

2-2-FA10μgL

敌克松()/皿

dexon50μg

丝裂霉素(,)/皿

CmtomcinCMMC0.5

yyμg

()培养基成分

6.3.1.12Voel-BonnerV-BE

g

枸橼酸(·)

CHOHO100g

6872

磷酸氢二钾()

KHPO500g

24

磷酸氢氨钠()

NaNHHPO.4HO175g

442

ㅤㅤㅤㅤ

硫酸镁()

MSO.7HO10

g42g

蒸馏水至1000mL

,,,

先将前三种成分加热溶解后再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中加蒸馏水稀释至1000mL分

装后0.103MPa高压灭菌30min。贮于4℃冰箱。

6.3.1.13顶层培养基成分

琼脂粉1.2g

氯化钠1.0g

蒸馏水至

200mL

,//。

0.103MPa高压灭菌20min后加入0.5mmolL组氨酸-0.5mmolL生物素溶液

6.3.1.14底层培养基成分

琼脂粉7.5g

蒸馏水480mL

V-B培养基E10mL

20%葡萄糖溶液10mL

,,。

先将前两种成分于0.103MPa高压灭菌20min后再加入后两种成分充分混匀倒底层平板按

,,。

每皿25mL~30mL倒平皿冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24h备用

6.3.1.15肉汤培养基成分

牛肉膏2.5g

胰胨

5.0g

3

/—

GBZT240.82011

磷酸氢二钾()

KHPO1.0g

24

蒸馏水至

500mL

,。。

将上述成分混合后于0.103MPa高压灭菌30min贮于4℃冰箱

6.3.1.16营养琼脂平板成分

琼脂粉7.5g

营养肉汤培养基500mL

,。

0.103MPa高压灭菌20min后倒斜面或平板

6.4菌株

、、、,、

一般使用鼠伤寒沙门氏菌或菌株需要时可选用

TA97aTA97TA98TA100TA102TA1535

TA1537等菌株。

6.4.1分离

将新获得的或经长期保存的试验菌株分别划线接种于主平板,培养。

37℃18h~24h

6.4.2增菌

用接种环分别刮取主平板中分离好的单个菌落分别接种于5mL新鲜营养肉汤内增菌,振荡

37℃

99

(次/)培养。该菌株培养物应每毫升不少于1×10~2×10活菌数。

100min10h

6.4.3保存

,ㅤㅤㅤㅤ、,

取增菌液0.8mL加高压灭菌DMSO0.07mL置于2mL已灭菌耐低温的带塞小塑料试管内冷

,。

冻后贮存于盛有液氮的液氮罐内冷藏备用置4℃冰箱可保存一个月

6.4.4菌株鉴定

,,

新获得的或长期保存的菌种在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定菌株鉴定的判断标准如表1

所示。

表1试验菌株鉴定的判断标准

脂多糖氨苄青

菌株组氨酸缺陷切除修复缺损四环素抗性自发回变菌落数

屏障缺损霉素抗性

TA97++++-90~180

TA98++++-30~50

TA100++++-100~200

TA102+++-+240~320

“”表示“”表示在体外代谢活

++*

“”表示“”表示“”表示

+++

备注:具有△uvrB具有AQI化条件下自发回变

p

需要组氨酸具有突变具有因子

rfaR

突变质粒菌落数略增

:。

注其他菌株生物特性鉴定参照有关文献

6.4.4.1组氨酸依赖性

,。

组氨酸营养缺陷型菌株只能在有组氨酸的营养培养基中生长在不加组氨酸的培养基上则不生长

4

/—

GBZT240.82011

将组氨酸营养缺陷型菌株分别用划线法接种于含有和不含有组氨酸的培养基中,培养,

37℃24h

。,

观察细菌生长情况组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长而在无组氨酸平板上则不能生长或仅

有少量增长。

6.4.4.2脂多糖屏障丢失

(),,

具有深粗型突变rfa的菌株其表面一层脂多糖屏障缺损因此一些大分子物质如结晶紫能穿透

,,。

菌膜进入菌体从而抑制其生长而野生型菌株则不受影响

,,

取0.1mL营养牛肉汤增菌液加到2mL45℃~46℃已融化的顶层琼脂中摇匀立即倒在有营养

,。,,

肉汤的底层琼脂培养基上使其均匀分布待琼脂凝固后在平皿中央放一直径为6mm的圆滤纸然

后将结晶紫水溶液(/)滴在滤纸上。培养。假若待测菌在滤纸片周围有清晰透

1mmL10L37℃24h

gμ

,,。

明的抑菌圈即表示结晶紫的分子已进入细菌体内说明该待测菌株具有突变

rfa

6.4.4.3紫外线损伤修复缺陷

具有紫外线损伤修复缺陷(),,,

△uvrB突变的菌株对紫外线敏感当受到紫外线照射后不能生长而

,。

具有野生型切除修复酶的菌株则能照常生长

,,

在营养牛肉汤琼脂培养基平皿的底部背面用红笔划一直线在培养基上沿红线用划线法接种细菌

,/,(),,。紫外线照射部分不

后用黑纸覆盖平皿的12其余部分用紫外线灯照射15W距离33cm照射8s

,。,,

能生长而黑纸覆盖的那一半则能生长具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感经辐射后细菌不生长

,。

而具有完整的切除修复系统的菌株则照常生长

抗氨苄青霉素因子鉴定

6.4.4.4R

ㅤㅤㅤㅤ

。,,

含因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性因为因子不太稳定容易丢失故用氨苄青霉素确

RR

定该质粒存在与否。

,,

在营养牛肉汤琼脂平皿背面中线用红笔划一直线再用微量注射器在培养基上沿红线涂10L氨

μ

,,。

苄青霉素待其干后与红线垂直方向划线接种细菌37℃培养24h若待测菌在涂有氨苄青霉素的部

,,,。

位生长说明该菌具有抗氨苄青霉素作用表示含有因子仍能生长否则表示待测菌不含因子或

RR

R因子丢失。

6.4.4.5抗四环素PA1质粒鉴定

Q

。,,

含PAQ1质粒的试验菌株对四环素有抗性因为PAQ1质粒不太稳定容易丢失故用四环素确

定该质粒存在与否。

,,

在营养牛肉汤琼脂平皿背面中线用红笔划一直线再用微量注射器在培养基上沿红线涂10L四

μ

,,。,

环素待其干后与红线垂直方向划线接种细菌37℃培养24h若待测菌在涂有四环素的部位生长说

,,。

明该菌具有抗四环素作用表示含有PAQ1质粒仍能生长否则表示待测菌不含PAQ1质粒或

PAQ1质粒丢失。

6.4.4.6自发回变

,。

每一种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变称为自发回变

,

将待测菌株增菌液加到含组氨酸生物素的顶层琼脂培养基的试管内混匀后铺

0.1mL2mL-

,,。

到底层琼脂平板上待琼脂固化后置37℃培养箱中孵育48h后记数每皿回变菌落数每种标准测

。,

试菌株的自发回变菌落数应符合表要求经体外代谢活化后的自发回变菌落数要比直接作用下

2

的略高。

5

/—

GBZT240.82011

表2测试菌株的回变性

剂量

诱变剂STA97TA98TA100TA102

9

μg/皿

柔毛霉素6.0-124312347592

叠氮化钠1.5-7633000188

ICR-1911.0-1640631850

链霉黑素0.25-inhinhinh2230

丝裂霉素C0.5-inhinhinh2772

,,三硝基芴酮0.20-8377824440016

247--9-

硝基次苯二胺

4--

O-20-216015997980

硝基喹啉氧化物

N-0.5-5282924220287

4--

甲基磺酸甲酯1.0-1742327306586

氨基芴

2-10+174261943026261

()

苯并芘

a1.0+337143937255

注:。;。

表示抑菌表中数值均已扣除溶剂对照的回变菌落数其他菌株对阳性物的反应参照有关文献

inh

6.4.4.7阳性对照物的回变菌落数

ㅤㅤㅤㅤ

6.5试验方法———平板掺入法

:,。无菌落生长

6.5.1倒平板先将底层培养基在45℃时倒平板冷却凝固后放入37℃培养箱内24h

方可使用。

://

6.5.2接种将含0.5mmolL组氨酸-0.5mmolL生物素溶液的顶层琼脂培养基2.0mL分装于试

,,,

管中水浴中保温然后每管依次加入试验菌株增菌液受试样品溶液和混合

45℃0.1mL0.1mLS

9

(),,,,。

液0.5mL需代谢活化时充分混匀迅速倾入底层琼脂平板上转动平板使之分布均匀水平放置

,。

待冷凝固化后倒置于培养箱里孵育每受试样品检测皿加或不加混合液均作三个平

37℃48hS

9

行皿。

:,

6.5.3对照每一受试样品检测时必须设定阳性物对照即将操作过程中加入受试样品溶液改换为阳

,;,,。

性物其他操作完全相同同时每批受试样品检测必须设定阴性对照观察自发回变菌落数操作过程

,。

中不加入受试样品其余操作同本部分6.5.2

6.5.4试验至少重复一次。

7数据处理与结果评价

7.1数据处理

、、,

记录受试样品各剂量组空白对照组自发回变溶剂对照组及阳性对照组的每皿回变菌落数并求

平均值和标准差。

7.2结果评价

,

受试样品诱发的回变菌落数超过自发回变菌落数倍以上并呈剂量反应关系判定检测结果

7.2.12-

6

/—

GBZT240.82011

为阳性。

,,或不加条件下为阳性

7.2.2受试样品经四个试验菌株检测后只要有一个试验菌株无论在加SS

99

,。

者时均可判定该受试样品Ames试验结果为阳性

,,

7.2.3四个试验菌株在加S和不加S条件下均为阴性且重复试验结果一致时则可判定受试样品

99

Ames试验结果为阴性。

8评价报告

/,:

除GBZT240.1规定的一般项目外评价报告还应包括以下内容

)试验菌株;

a

)代谢活化系统及所用诱导剂;

b

)、、、;

c试验方法操作步骤受试样品检测剂量分组及阴性阳性对照名称

)阳性结果评价原则以列表方式报告受试样品的试验结果;

dAmes

)结论。

e

9结果解释

。

阳性结果表明在本试验条件下受试样品具有致基因突变作用阴性结果表明在本试验条件下受试

样品不具有致基因突变作用。

ㅤㅤㅤㅤ

/—1

GBZT240.820111

0

—

2

8.

附录

A0

4

()

资料性附录2

/

大鼠肝微粒体酶的诱导和的制备T

S

9

Z

B

G

A.1诱导

(),

应用最广泛的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯Arodor1254混合物选择健康雄性大鼠体重

,/。,/。

200左右