GBZ/T(卫生) 240.9-2011 化学品毒理学评价程序和试验方法 第9部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

ICS13.100

C52

中华人民共和国国家职业卫生标准

/—

GBZT240.92011

化学品毒理学评价程序和试验方法

:

第部分体外哺乳动物细胞

9

ㅤㅤㅤㅤ

染色体畸变试验

—

Proceduresandtestsfortoxicoloicalevaluationsofchemicals

g

:

Part9Invitromammalianchromosomeaberrationtest

2011-08-19发布2012-03-01实施

中华人民共和国卫生部发布

/—

GBZT240.92011

化学品毒理学评价程序和试验方法

:

第部分体外哺乳动物细胞

9

染色体畸变试验

1范围

/、、、

GBZT240的本部分规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验目的试验概述试验方法数据处

、。

理与结果评价评价报告和结果解释

本部分适用于检测化学品可能引起的细胞遗传学毒性。

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅所注日期的版本适用于本

。,()。

文件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/职业卫生名词术语

GBZT224

/:

化学品毒理学评价程序和试验方法第部分总则

GBZT240.11

3术语和定义

ㅤㅤㅤㅤ

/界定的术语和定义适用于本文件。

GBZT240.1

3.1

染色体型畸变chromosome-teaberration

yp

在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的结构改变。

3.2

染色单体型畸变chromatid-teaberration

yp

染色单体断裂或染色单体断裂重组的结构损伤改变。

3.3

染色体数目畸变chromosomalnumericalaberration

,。

染色体数目发生改变不同于正常核型

3.4

染色体结构畸变chromosomalstructureaberration

。

通过显微镜可以直接观察到的发生在细胞有丝分裂中期的染色体的结构变化如染色体中间缺失

,。

和断片染色体互换和内交换等

3.5

有丝分裂指数mitoticindex

,。

中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值是一项反映细胞增殖程度的指标

4试验目的

,。

通过检测受试样品诱发体外培养的哺乳动物细胞染色体畸变的能力从而评价受试样品的致突变性

1

/—

GBZT240.92011

5试验概述

,。

在加或不加入代谢活化系统的条件下使培养的哺乳动物细胞暴露于受试样品中用中期分裂相

(),,、、、。

阻断剂如秋水仙素处理使细胞停止在中期分裂相随后收获细胞制片染色分析染色体畸变

6试验方法

6.1受试样品处理

。,。

受试样品一般应新鲜配制如果溶液贮存稳定可以不必新鲜配制固体受试样品应溶解或悬浮

,。。

于适合的溶剂中并稀释至一定浓度液体受试样品可直接使用或予以稀释

6.2剂量水平

,。

受试样品至少应取个检测剂量检测范围建议覆盖两个倍稀释系列对有细胞毒性的受试样

310

,;,

品其剂量范围应包括从最大毒性至几乎无毒性当收获细胞时高剂量应能明显减少细胞计数或有丝

();,/、/

分裂指数均应大于50%对无细胞毒性或细胞毒性很小的化合物高剂量应达到5LmL5mmL

μg

/。。

或0.01molL应在预试验中确定细胞毒性和溶解度测定细胞毒性可使用指示细胞完整性和生长

,。

情况的指标如相对集落形成率或相对细胞生长率等应在系统存在或不存在的条件下测定细胞毒

S

9

。,,

性对于相对不溶解的物质当达到不溶解浓度时仍无毒性则高剂量应采用最终培养液中溶解度限值

。,,,

以上的一个浓度在某些情况下应使用一个以上可见沉淀的浓度溶解性可用肉眼鉴别但沉淀不能

影响观察。

ㅤㅤㅤㅤ

6.3对照组

6.3.1阳性对照

,,、

可根据受试样品的性质和结构选择适宜的阳性对照物应是已知的断裂剂能引起可检出的并可

重复的阳性结果。

,:

当不存在外源性代谢活化系统时可使用的阳性对照物有

———甲磺酸甲酯();

methlmethanesulhonate

yp

———甲磺酸乙酯();

ethlmethanesulhonate

yp

———丝裂霉素();

CmtomcinC

yy

———乙基亚硝基脲();

ethlnitrosourea

y

———()。

硝基喹啉氧化物等

N-4-nitrouinolineN-oxide

4--q-

,:

当存在外源性活化系统时可使用的阳性对照物有

———()(());

苯并芘

abenzoarene

py

———()。

环磷酰胺cclohoshamide等

ypp

6.3.2阴性对照

):,,。

介质对照介质应为非致突变物不与受试样品发生化学反应不影响细胞存活和活性首

aS

9

,(),。

选介质是水或水溶性溶剂亦可使用二甲基亚砜DMSO但浓度不应大于0.5%

):。

b空白对照如果没有文献资料或历史资料证实所用介质无致突变作用时应设空白对照

6.4细胞株

()()、(

可选用中国地鼠肺CHL细胞株或卵巢CHO细胞株人或其他哺乳动物外周血淋巴细胞lm

y-

2

/—

GBZT240.92011

)。一般推荐使用中国地鼠肺()细胞株。

hocteCHL

py

6.5试剂配制

培养液()

6.5.1MEMEale

g

(/、/),

加入非必需氨基酸和抗菌素青霉素按100IUmL链霉素100μgmL胎牛血清或小牛血清按

。。

10%加入也可选用其他合适的培养液

6.5.2代谢活化系统

,。

大鼠肝微粒体酶其诱导和制备方法见附录

SA

9

6.5.30.04%秋水仙素溶液

,。

取40mg秋水仙素溶解于100mL无菌0.85%氯化钠溶液中过滤除菌

/氯化钾溶液

6.5.40.075molL

6.5.5固定液

,。

甲醇冰醋酸临用前配制

∶=3∶1

6.5.6姬姆萨染液

,,。,,

取姬姆萨染料3.8g置玛瑙乳钵中加少量甲醇研磨逐渐加甲醇至375mL待完全溶解后再加

,。,。,,

125mL甘油放入37℃温箱中保温48h保温期间振摇数次使充分溶解取出过滤2周后使用作

。,ㅤㅤㅤㅤ,//(),

为姬姆萨染液原液使用时取份姬姆萨染液原液与份lL磷酸盐缓冲液H6.8混合

19115mop

配成其应用液。

磷酸盐缓冲液(//,)配制方法如下:

115molLH6.8

p

———:,//。

第一液取磷酸氢二钠9.47g溶于蒸馏水1000mL中配成115molL溶液

———:,//。

第二液取磷酸二氢钾49.07g溶于蒸馏水1000mL中配成115molL溶液

,//。

取第一液加于第二液中混匀即为的缓冲液

49.5mL50.5mLpH6.8115molL

6.6试验步骤

6.6.1细胞培养与染毒

。,(),

试验需在加入和不加入的条件下进行试验前一天将一定数量的细胞接种于培养皿瓶中

S

9

。(),、(

放培养箱内培养试验时吸去培养皿瓶中的培养液加入一定浓度的受试样品混合液不

COS

29

,),,

加混合液时需用培养液补足以及一定量不含血清的培养液放培养箱中根据细胞周期决定处理

S

9

。,,,,

结束后吸去含受试样品的培养液用液洗细胞次加入含胎牛血清的培养液

2h~6hHanks310%

,。,(,

放回培养箱于或内收获细胞收获前加入细胞分裂中期阻断剂如用秋水仙素

24h48h2h~4h

,/)。

作用时间为4h终浓度为1mL

μg

,,

如果在上述加入和不加入混合液的条件下均获得阴性结果则需加做长时间处理的试验即在

S

9

,。,

没有混合液的条件下使受试样品与试验系统的接触时间延长至当难以得出明确结论时应

S24h

9

,、。

更换试验条件如改变代谢活化条件受试样品与试验系统接触时间等重复试验

6.6.2收获细胞与制片

:,,

6.6.2.1消化用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞待细胞脱落后加入含10%胎牛或小牛血清的培养

,,//,

液终止胰蛋白酶的作用混匀放入离心管以1000rmin~1200rmin的速度离心5min~7min弃去

3

/—

GBZT240.92011

上清液。

:/,,

6.6.2.2低渗加入0.075molLKCl溶液7mL用滴管将细胞轻轻地混匀放入37℃水浴中低渗处

,(),/

理加入固定液甲醇冰醋酸混匀以速度离心

10min~15min2mL∶3∶11500rmin5min~

,。

7min弃去上清液

:,,/,。

固定加入固定液混匀后固定以速度离心弃去上清液用

6.6.2.37mL7min1500rmin7min

,。

同法再固定次次弃去上清液

1~2

:,。,。

6.6.2.4滴片加入数滴新鲜固定液混匀用混悬液滴片自然干燥

:。

6.6.2.5染色用姬姆萨染液染色

6.6.3镜检

,。

每一剂量组选择200个分散良好的中期分裂相在显微镜油镜下进行读片在读片时应记录每一

,。、

观察细胞的染色体数目对于畸变细胞还应记录显微镜视标位置及畸变类型所有处理组阳性和阴性

。。

对照组均需测定有丝分裂指数每一剂量组应分析不少于1000个分散良好的中期分裂相

7数据处理与结果评价

7.1数据处理

、、

结果数据的计算指标包括每个细胞染色体畸变数染色体结构异常百分率各剂量组及对照组不同

。,。

类型染色体异常数与频率等分裂细胞数应另计一般不包括在总异常频率中所得各组的染色体畸

2

,。

变率用Χ检验进行统计学处理以评价剂量组和对照组之间是否有显著性差异

7.2结果评价ㅤㅤㅤㅤ

在下列两种情况下可判定受试样品在本试验系统中为阳性结果:

),;

a受试样品引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义并有与剂量相关的增加

),,

b受试样品在任何一个剂量条件下引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义并有可重

。。

复性评价时应综合考虑生物学和统计学意义

8评价报告

/,:

除GBZT240.1规定的一般项目外评价报告还应包括以下内容

)、(、);

a所用溶剂及其配制剂量选择应说明受试样品的细胞毒性测定方法溶解情况等

)细胞株名称;

b

)试验条件和方法;

c

———、;

代谢活化系统所用酶诱导剂来源及混合液配方

S

9

———培养液名称与血清类别和使用溶解情况;

———,();

阳性对照物名称和选用浓度阴性溶剂对照物名称及使用浓度

———();

接种的细胞密度以及所用培养皿瓶的规格

———、;

中期分裂阻断剂名称所用浓度和作用时间

———受试样品与试验系统的接触时间。

)简述制片方法;

d

)、、、、()、(

e毒性特征细胞周期资料分裂指数受试样品的pH值畸变包括裂隙分析各试验组剂量

、、)、、、、

组阳性组阴性组染色体畸变数目及畸变类型畸变范围剂量反应关系统计处理方法本

-

、();

实验室历史上的染色体畸变率范围均值和标准差说明样品数

4

/—

GBZT240.92011

)结论。

f

9结果解释

。

阳性结果表明受试样品在该试验条件下可引起所用哺乳动物细胞染色体畸变阴性结果表明在该

试验条件下受试样品不引起所用哺乳动物动物细胞染色体畸变。

ㅤㅤㅤㅤ

5

/—

GBZT240.92011

附录

A

()

资料性附录

大鼠肝微粒体酶的诱导和S的制备

9

A.1诱导

(),

应用最广泛的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯PCB混合物选择健康雄性大鼠体重200g

,/。,/。

左右一次腹腔注射诱导剂500mk诱导剂溶于玉米油中浓度为200mmL

ggg

A.2S制备

9

。,。,

动物诱导后第五日断头处死处死前12h停止饮食但可自由饮水首先用75%酒精消毒动物

,。,,,/

皮肤剖开腹部在无菌条件下取出肝脏去除肝脏的结缔组织用冰浴的0.15molL氯化钾淋洗肝

,/。/。用电

脏放入盛有0.15molL氯化钾溶液的烧杯里按每克肝脏加入0.15molL氯化钾溶液3mL

,,,,

动匀浆器制成肝匀浆再在低温高速离心机上在4℃条件下以9000g离心10min取其上清液分装

。。。

于塑料管中每管装2mL~3mL储存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中备用

。、,

上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行制备肝所用一切手术器械器皿等均经灭菌

S

9

消毒。,。

S制备后其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定

9

ㅤㅤㅤㅤ

6