GBZ/T(卫生) 240.12-2011 化学品毒理学评价程序和试验方法 第12部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验

ICS13.100

C52

中华人民共和国国家职业卫生标准

/—

GBZT240.122011

化学品毒理学评价程序和试验方法

:

第部分体内哺乳动物骨髓细胞染色体

12

ㅤㅤㅤㅤ

畸变试验

—

Proceduresandtestsfortoxicoloicalevaluationsofchemicals

g

:

Part12Invivomammalianbonemarrowchromosomeaberrationtest

2011-08-19发布2012-03-01实施

中华人民共和国卫生部发布

/—

GBZT240.122011

化学品毒理学评价程序和试验方法

:

第部分体内哺乳动物骨髓细胞染色体

12

畸变试验

1范围

/、、、

GBZT240的本部分规定了体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验的目的试验概述试验方法

、。

数据处理与结果评价评价报告和结果解释

本部分适用于检测化学品对骨髓细胞的遗传毒性。

2规范性引用文件

。,

下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅所注日期的版本适用于本

。,()。

文件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件

/职业卫生名词术语

GBZT224

/:

化学品毒理学评价程序和试验方法第部分总则

GBZT240.11

3术语和定义ㅤㅤㅤㅤ

/界定的术语和定义适用于本文件。

GBZT240.1

3.1

染色单体型畸变chromatid-teaberration

yp

染色单体断裂或染色单体断裂重组的结构损伤。

3.2

染色体型畸变chromosome-teaberration

yp

为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组改变的结构损伤。

3.3

核内复制endoredulication

p

,。

在复制的期之后细胞核未进行有丝分裂就开始了另一个期的过程其结果是染色体

DNASS

有,,,…倍的染色质。

4816

3.4

裂隙a

gp

,。

染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度为染色单体的最小的错误排列

3.5

染色体数目畸变chromosomalnumericalaberration

,。

染色体数目发生改变不同于正常核型

3.6

多倍体olloid

pypy

,,、

哺乳动物染色体数目正常是二倍体在化学诱变剂的作用下染色体数目成倍地增加成三倍体四

1

/—

GBZT240.122011

倍体等。

3.7

染色体结构的畸变chromosomalstructureaberration

。

通过显微镜可以直接观察到的发生在细胞有丝分裂中期的染色体的结构变化如染色体中间缺失

,。

和断片染色体互换和内交换等

4试验目的

,,

本试验是一项致突变试验用来检测整体动物骨髓细胞染色体畸变以评价受试样品致突变的可

能性。

5试验概述

,。,

动物通过适当的途径接触受试样品一定时间后处死动物动物处死前用细胞分裂中期阻断剂处

,,、,,

理处死后取出骨髓经低渗固定后制备骨髓细胞染色体标本经染色在显微镜下观察中期分裂相细

,。

胞分析细胞染色体畸变

6试验方法

6.1试剂

ㅤㅤㅤㅤ

:,。

6.1.10.1%秋水仙素置于棕色瓶中冰箱保存

6.1.20.9%氯化钠溶液。

/氯化钾溶液。

6.1.30.075molL

:,。

6.1.4固定液甲醇与冰醋酸以3∶1混合临用时现配

():

6.1.5姬姆萨Giemsa染液

染料3.8

Giemsag

甲醇375mL

甘油125mL

:,,,

配制将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨再加入甲醇至375mL待完全溶解后再加

,。。,。

入125mL甘油混合均匀置37℃恒温箱中保温48h保温期间振摇数次促使染料的充分溶解

,。

取出过滤两周后使用

6.1.6磷酸缓盐冲液(H7.4):

p

//:()。

115molL磷酸氢二钠溶液磷酸氢二钠NaHPO9.47g溶于1000mL蒸馏水中

24

//:()。

115molL磷酸二氢钾溶液磷酸二氢钾KHPO49.07g溶于1000mL蒸馏水中

24

取//磷酸氢二钠溶液与//磷酸二氢钾溶液混合。

115molL80mL115molL20mL

6.1.7Giemsa应用液:

//。。

取份染液与份磷酸缓盐冲液混合而成临用时配制

1Giemsa9115molL

,,。

全部试剂除注明外均为分析纯试验用水为蒸馏水

6.2受试样品处理

。,。

受试样品一般应新鲜配制如果有资料证明以溶液贮存稳定可以不必新鲜配制固体受试样品

,。。

应溶于或悬于适当的溶剂或载体中并进行稀释液体受试样品可直接使用或稀释后使用根据受试

2

/—

GBZT240.122011

(/)。

样品的理化性质水溶性脂溶性确定受试样品所用的溶剂或载体但所用溶剂或载体在使用剂量水

,。、、、

平对实验动物应不产生毒作用且不与受试样品发生任何化学反应通常用蒸馏水等渗盐水植物油

、。,。

食用淀粉羧甲基纤维素钠等如非常用的溶剂或载体应有参考资料说明其成分及选做溶剂的原因

6.3对照

(/),,

6.3.1每次试验每一性别都应设置相应的阳性和阴性对照溶剂载体除不使用受试样品外其他处

理与受试样品组一致。

。

6.3.2阳性对照组动物体内应能形成可被检测的高于背景的骨髓细胞染色体结构畸变阳性对照组

,。

剂量设置应使致染色体畸变效应明显但以不能使看片者一看即知编码玻片底细可只取一个采样点

。。:

来证明阳性对照最好使用与受试样品化学分类相关的阳性对照化合物常用的阳性对照物有

———甲磺酸乙酯(,号);

ethlmethanesulhonateCAS62-50-0

yp

———乙基亚硝基脲(,号);

ethlnitrosoureaCAS759-73-9

y

———丝裂霉素(,号);

CmitomcinCCAS50-07-7

y

———环磷酰胺(,号);

cclohoshamideCAS50-18-0

ypp

———单水环磷酰胺(,号);

cclohoshamidemonohdrateCAS6055-19-2

yppy

———三亚乙基嘧胺(,号)。

triethlenemelamineCAS51-18-3

y

。,

6.3.3阴性对照由溶剂或载体组成是否在每个采样时间点均设置阴性对照可依据动物间的变异和

。,

历史对照资料中的细胞染色体畸变频率判断如果采用一个采样时间点作阴性对照最适采样时间点

。,,

是第一采样时间点另外如果没有历史对照资料证明所用溶剂或载体无诱导缺失或突变效应还应设

空白对照。

6.4实验动物和饲养环境ㅤㅤㅤㅤ

:、,

6.4.1实验动物大鼠小鼠和中国仓鼠是骨髓细胞染色体畸变试验常规使用动物其他合适的哺乳动

。,,。,

物也可选用应使用健康年轻的成熟动物如使用小鼠周龄周周为最好试验初始动物体重

7~12

,。,

变化应尽量小即不能超过雌雄动物平均体重的20%动物应随机分组每个处理组和对照组每性别

。,

都应有至少只能用于分析的动物如试验设有几个采样时间点则要求每组每性别每个采样时间点

5

。,

都有只能用于分析的动物如果有资料证明两性别间毒性作用无差别则可只用一种性别的动物做

5

。,,。

试验对人群暴露有性别差异的化学物质如某些药剂则要用相应性别的动物做试验动物购回后应

适应实验室新环境至少3d~5d。

,

6.4.2实验动物和动物实验的环境设施应符合国家相应规定应有合理的动物管理措施并严格控制环

,。、、、、、、

境条件尽量减少人员流动饲养条件疾病药物治疗饲料的杂质空气饮水垫料等都可能对试验

结果产生巨大影响。

6.5剂量水平

,。

6.5.1应进行预试验以选择高剂量为避免出现假阴性结果应适当增大剂量范围如果受试样品具

,。

有毒性应在第一个采样时间点在最大毒性至最小毒性或无毒性的范围内设三个剂量第二次采样时

。。,

间点仅需设置高剂量高剂量是能使动物出现严重中毒反应的剂量而有特异生物学活性的物质在

()。

低或无毒剂量如激素和丝裂源可采用其他剂量设置标准高剂量也可为能在骨髓中产生明显毒性的

()。、。

剂量如抑制骨髓细胞有丝分裂指数达以上按等比级数向下设置中低剂量组

50%2

/,,

6.5.2如剂量水平大于或等于2000mk体重24h内进行一次或两次染毒不产生可观察到的毒

gg

,,。

性效应并且根据结构相关物质的资料不能推断受试样品有遗传毒性则不必设三个剂量如染毒14d

则高剂量选用每天/,/。

2000mk染毒14d以上高剂量选用每天1000mk如欲外推人群接触的

gggg

,。

阈剂量可能需要采用更高的剂量水平

3

/—

GBZT240.122011

6.6试验步骤

6.6.1实验动物的处理和采样时间点

,。

6.6.1.1根据试验目的或受试样品的性质选择染毒途径宜采用经口灌胃或腹腔注射方式

受试样品一次给予的最大容量不应超过/。

6.6.1.220mLkg

,,,,

6.6.1.3一般情况下染毒一次或者为便于大容量给药也可分散剂量染毒即同一日染毒两次其间

。。

隔时间不超过几小时若采用其他染毒方式应予以说明

、,,

6.6.1.4高剂量组动物分为AB两个亚组分两次采集样品啮齿类动物采样时间一般为1.5个正常

,。

细胞周期的间隔期即组于末次染毒后采集样品组于末次染毒后采集样

A12h~18hB36h~42h

;、。,

品中低剂量组均于末次染毒后12h~18h采集样品如果采用多次染毒方式只需在最后一次染毒

后12h~18h采一次样。

6.6.1.5于处死动物采集样品前3h~5h腹腔注射秋水仙素(/)。

4mk

gg

6.6.2制片

:,,,,

6.6.2.1骨髓细胞悬液的制备用颈椎脱臼法处死动物迅速取出股骨剔去肌肉擦净血污剪去两端

,,,,

的骨骺用注射器吸取生理盐水插入骨髓腔内将骨髓冲洗入离心管然后用吸管吹打骨髓团块使其均

,/,。

匀以1000rmin速度离心10min用滴管吸去上清液

:/,,

6.6.2.2低渗加入0.075molL氯化钾溶液9mL用滴管将细胞轻轻地混匀放入37℃水浴中低渗

20min。

:(),,/

预固定立即加入固定液甲醇冰醋酸混匀以1000rmin速度离心

6.6.2.3∶=3∶11mL

ㅤㅤㅤㅤ

,。

10min用滴管吸去上清液

:,,,/,

6.6.2.4固定加入7mL固定液混匀固定10min~20min以1000rmin速度离心10min用滴

。。

管吸去上清液用同法再固定次

2

,。

6.6.2.5加入0.1mL~0.5mL新鲜固定液用细口滴管充分混匀

,,

在洁净的冷冻玻片上滴滴滴细胞悬液轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上将玻片在酒

6.6.2.63~4

精灯,。。

上微热烘烤空气中自然干燥每个标本制片张张

2~3

:,、。

6.6.2.7染色将制备好的标本片放入Giemsa应用液中染色15min~20min用蒸馏水冲洗晾干

6.6.3阅片

,,。

6.6.3.1所有玻片包括阳性对照和阴性对照在镜检前要分别编号

,,、、

6.6.3.2在低倍镜下检查制片质量制片应全部染色体较集中而各个染色体分散互不重叠长短收

、、、。。

缩适中两单体分开清晰地显示出着丝点位置染色体呈红紫色用油镜进行细胞中期染色体分析

;、(

6.6.3.3确定有丝分裂指数包括所有处理组阴性对照组和阳性对照组每只动物计数1000个

细胞)。

:。,

6.6.3.4计数畸变细胞用双盲法阅片每只动物至少分析100个分散良好的中期分裂相细胞每只

,。

动物至少分析1000个细胞测定有丝分裂释放以确定细胞毒性在阅片时应记录每一观察细胞的染

,。

色体数目对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型

6.6.3.5观察项目:

):(),,。

a染色体数目的改变非整倍体亚二倍体或超二倍体多倍体核内复制

):、、、、、、

b染色体结构的改变断裂微小体有着丝点环无着丝点环单体互换双微小体裂隙和非特

(、、)。

定性型变化如粉碎化着丝点细长化粘着等

4

/—

GBZT240.122011

7数据处理与结果评价

7.1数据处理

,。、

每一实验动物作为一个观察单位每组动物按性别分别计算染色体结构畸变细胞百分率若雌雄

。。

动物之间无明显的性别差异时可合并计算结果一般用卡方检验方法进行统计学分析裂隙应分别记

,。

录和报告但一般不计入总的畸变率

7.2结果评价

。

评价时应从生物学意义和统计学意义两个方面进行分析受试样品组细胞染色体畸变率与阴性对

,,,

照组相比细胞染色体结构畸变数增加或异常中期分裂相增加统计学意义上有显著性差异并呈剂量-

,,

反应关系或在一个受试样品组出现染色体畸变细胞数明显增高时并经重复试验证实即可认为染色体

。,,,

畸变试验阳性若统计学上差异有显著性但无剂量反应关系则须进行重复试验结果能重复者可确

-

定为染色体畸变试验阳性。

。

多倍体的增加提示受试样品具有潜在的诱导染色体数目畸变的作用核内复制的增加提示受试样

品具有潜在的抑制细胞发育的作用。

8评价报告

/,:

除GBZT240.1规定的一般项目外评价报告还应包括以下内容

)、、、

a受试样品稳定性配制方法所用溶剂或载体及其选择的理由受试样品在溶剂中的溶解度和

ㅤㅤㅤㅤ

饱和度;

)/、、、、(、

b实验动物种属品系数量年龄性别试验开始时各动物的体重包括体重范围每组动物体

)、();

重平均值和标准差来源注明合格证号和动物级别

),()、、、、

c实验动物饲养环境包括饲料来源注明合格证号饮水质量室温相对湿度动物实验室合

格证号;

),()、

d剂量分组及选择剂量的基本原则阳性和阴性对照资料包括当前和历史的资料染毒途径

,;

和方式采样时点

)、;

e细胞分裂中期阻断剂名称使用浓度及处理间隔时间

):,,;

f试验方法简述操作步骤所用统计学方法结果判定标准

):、、、

结果中毒症状有丝分裂指数每只动物细胞染色体畸变类型和畸变数每组动物细胞畸变

g

、、、、

总数及均数和标准差每组畸变细胞数及均值和标准差多倍体剂量反应关系阴性对照的

-

、、、。

参考资料历史资料及范围均值和标准差阳性对照的参考资料等以列表方式报告受试样

、;

品组溶剂对照组和阳性对照组动物骨髓细胞染色体畸变类型和数量及畸变率

)结论。

h

9结果解释

。

阳性结果表明在本试验条件下受试样品具有引起受试动物骨髓细胞染色体畸变的能力阴性结果

表明在本试验条件下受试样品不引起受试动物骨髓细胞染色体畸变。

5