GB 4789.30-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验

中华人民共和国国家标准

GB4789.30—2010

食品安全国家标准

食品微生物学检验

单核细胞增生李斯特氏菌检验

Nationalfoodsafetystandard

Foodmicrobiologicalexamination:Listeriamonocytogenes

中华人民共和国卫生部发布

2010-03-26发布2010-06-01实施

GB4789.30—2010

I

前言

本标准代替GB/T4789.30-2008《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》。

本标准与GB/T4789.30-2008相比，主要变化如下：

——修改了标准的中英文名称；

——删除“第二法全自动酶链荧光免疫分析仪筛选法”；

——删除“第三法全自动病原菌检测系统筛选法”。

本标准的附录A为规范性附录。

本标准所代替标准的历年版本发布情况为：

——GB4789.30-1994、GB/T4789.30-2003、GB/T4789.30-2008。

GB4789.30—2010

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食品安全国家标准

食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验

1范围

本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的检验方法。

本标准适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。

2设备和材料

除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1冰箱：2℃～5℃。

2.2恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃。

2.3均质器。

2.4显微镜：10×～100×。

2.5电子天平：感量0.1g。

2.6锥形瓶：100mL、500mL。

2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。

2.8无菌平皿：直径90mm。

2.9无菌试管：16mm×160mm.。

2.10离心管：30mm×100mm。

2.11无菌注射器：1mL。

2.12金黄色葡萄球菌（ATCC25923）。

2.13马红球菌（Rhodococcusequi）。

2.14小白鼠：16g～18g。

2.15全自动微生物生化鉴定系统。

3培养基和试剂

3.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）：见附录A中A.1。

3.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。

3.3李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见附录A中A.3。

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3.41%盐酸吖啶黄（acriflavineHCl）溶液：见附录A中A.3.2.1。

3.51%萘啶酮酸钠盐（naladixicacid）溶液：见附录A中A.3.2.1。

3.6PALCAM琼脂：见附录A中A.4。

3.7革兰氏染液：见附录A中A.5。

3.8SIM动力培养基：见附录A中A.6。

3.9缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红（MR）和V-P试验用]：见附录A中A.7。

3.105%～8%羊血琼脂：见附录A中A.8。

3.11糖发酵管：见附录A中A.9。

3.12过氧化氢酶试验：见附录A中A.10。

3.13李斯特氏菌显色培养基。

3.14生化鉴定试剂盒。

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4.检验程序

单核细胞增生李斯特氏菌检验程序见图1。

图1单核细胞增生李斯特氏菌检验程序

5操作步骤

5.1增菌

以无菌操作取样品25g（mL）加入到含有225mLLB1增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续

均质1min～2min；或放入盛有225mLLB1增菌液的均质杯中，8000r/min～10000r/min均质1min～2

min。于30℃±1℃培养24h，移取0.1mL，转种于10mLLB2增菌液内，于30℃±1℃培养18h～24h。

5.2分离

取LB2二次增菌液划线接种于PALCAM琼脂平板和李斯特氏菌显色培养基上，于36℃±1℃培养

24h～48h，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，

周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；典型菌落在李斯特氏菌显色培养基上的特征按照产品说明

进行判定。

5.3初筛

自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于36

℃±1℃培养24h；同时在TSA-YE平板上划线纯化，于30℃±1℃培养24h～48h。选择木糖阴性、鼠

李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。

30℃±1℃，18h～24h

30℃±1℃，24h

检样

25g(mL)样品+LB1增菌液225mL，均质

0.1mL+10mLLB2增菌液

36℃±1℃，24h～48h

李斯特氏菌显色培养基PALCAM琼脂

接种木糖、鼠李糖，36℃±1℃，24h；同时于

TSA-YE平板划线纯化，30℃±1℃，24h～48h

木糖－，鼠李糖＋

鉴定

结果报告

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5.4鉴定

5.4.1染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4μm～0.5μm）×（0.5μm～2.0μm）；

用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。

5.4.2动力试验：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。

5.4.3生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续

进行糖发酵试验和MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。

5.4.4溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为20个～25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血

平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺

克李斯特氏菌)，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36℃±1℃培养24h～48

h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李

斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。

5.4.5协同溶血试验(cAMP)：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄