GB 4789.38-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数

中华人民共和国国家标准

GB4789.38-2012

食品安全国家标准

食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数

2012-05-17发布2012-07-17实施

中华人民共和国卫生部发布

GB4789.38-2012

前言

本标准代替GB/T4789.38-2008《食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数》。

本标准与GB/T4789.38-2008相比，主要变化如下：

——修改了标准的中文名称；

——修改了培养基和试剂；

——将“第二法大肠杆菌VRB-MUG平板计数法”改为“大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）”；

TM

——删除了“第三法大肠杆菌Petrifilm测试片计数法”；

——修改了附录A。

I

GB4789.38-2012

食品安全国家标准

食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数

1范围

本标准规定了食品中大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）计数的方法。

本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）不适用于贝类产

品。

2术语和定义

2.1大肠埃希氏菌Escherichiacoli

大肠杆菌

广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP

试验、柠檬酸盐）生化试验为＋＋－－或－＋－－的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品

的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。

2.2最可能数

基于泊松分布的一种间接计数方法，简称为MPN。

3设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

a）恒温培养箱：36℃±1℃；

b）冰箱：2℃～5℃；

c）恒温水浴箱：44.5℃±0.2℃；

d）天平：感量为0.1g；

c）均质器；

d）振荡器；

e）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头；

f）无菌锥形瓶：容量500mL；

g）无菌培养皿：直径90mm；

h）pH计或pH比色管或精密pH试纸；

i）菌落计数器；

j）紫外灯：波长360nm～366nm，功率≤6W。

4培养基和试剂

4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤：见附录A中A.1。

4.2EC肉汤（E.colibroth）：见附录A中A.2。

4.3蛋白胨水：见附录A中A.3。

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4.4缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]：见附录A中A.4。

4.5西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A中A.5。

4.6磷酸盐缓冲液：见附录A中A.6。

4.7伊红美蓝（EMB）琼脂：见附录A中A.7。

4.8营养琼脂斜面：见附录A中A.8。

4.9结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：见附录A中A.9。

4.10结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷琼脂（VRBA-MUG）：见附录A中A.10。

4.11革兰氏染色液：见附录A中A.11。

4.12Kovacs靛基质试剂：见附录A中A.12。

4.13无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.13。

4.14无菌1mol/LHCl：见附录A中A.14。

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5大肠埃希氏菌MPN计数（第一法）

5.1检验程序

大肠埃希氏菌MPN计数的检验程序见图1。

检样

25gmL+225ml

（）样品稀释液，均质

10倍系列稀释

3LST

选择适宜个连续稀释度的样品匀液，接种肉汤管

36±148h±2h

℃℃

不产气产气

EC肉汤

44.5℃±0.2℃48h±2h

不产气产气

EMB平板划线

36℃±1℃18h～24h

可疑菌落移种营养琼脂斜面或平板

36℃±1℃18h～24h

IMViC生化试验，革兰氏染色

阴性管阳性管

查MPN表

报告

图1大肠埃希氏菌MPN计数法检验程序

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GB4789.38-2012

5.2操作步骤

5.2.1样品的稀释

5.2.1.1固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000

r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质

袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:10的样品匀液。

5.2.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适

当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。

5.2.1.3样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。

5.2.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液

的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复

吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

5.2.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1

次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

5.2.2初发酵试验

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管

月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1

℃培养24h±2h，观察小倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养

48h±2h。产气者进行复发酵试验。如所有LST肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果。

5.2.3复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于已提前预温至45℃的EC肉汤管中，放

入带盖的44.5℃±0.2℃水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h，检查小倒管内是否

有气泡产生，如未有产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的EC肉汤管数。如所有EC

肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。

5.2.4伊红美蓝平板分离培养

轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB平板，36℃±1℃培养18h～24h。观察

平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

5.2.5营养琼脂斜面或平板培养

从每个平板上挑5个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到

营养琼脂斜面或平板上，36℃±1℃，培养18h～24h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。

5.2.6鉴定

取培养物进行靛基质试验、MR-VP试验和柠檬酸盐利用试验。大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生

化鉴别见表1。

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表1大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别

靛基质（I）甲基红（MR）VP试验（VP）柠檬酸盐（C）鉴定（型别）

＋＋－－典型大肠埃希氏菌

－＋－－非典型大肠埃希氏菌

＋＋－＋典型中间型

－＋－＋非典型中间型

－－＋＋典型产气肠杆菌

＋－＋＋非典型产气肠杆菌

1

注1：如出现表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。

注2：生化试验也可以选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等方法，按照产品说明书进行操作。

5.3大肠埃希氏菌MPN计数的报告

大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为＋＋――或－＋

－－。只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST

肉汤阳性管数查MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌MPN值。

6大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）