GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验

中华人民共和国国家标准

—

GB4789.42016

食品安全国家标准

食品微生物学检验沙门氏菌检验

2016-12-23发布2017-06-23实施

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会

发布

国家食品药品监督管理总局

—

GB4789.42016

前言

本标准代替—《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》、

GB4789.42010

—《()》、/—《

SN01701992出口食品沙门氏菌属包括亚利桑那菌检验方法SNT2552.52010乳及乳制品卫

:》。

生微生物学检验方法第部分沙门氏菌检验

5

—,:

整合后的标准与GB4789.42010相比主要变化如下

———修改了检测流程和血清学检测操作程序;

———修改了附录和附录。

AB

Ⅰ

—

GB4789.42016

食品安全国家标准

食品微生物学检验沙门氏菌检验

1范围

本标准规定了食品中沙门氏菌()的检验方法。

Salmonella

本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。

2设备和材料

,:

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外其他设备和材料如下

冰箱:。

2.12℃~5℃

恒温培养箱:,。

2.236℃±1℃42℃±1℃

2.3均质器。

2.4振荡器。

:。

2.5电子天平感量0.1g

:,。

2.6无菌锥形瓶容量500mL250mL

:()、()。

无菌吸管具刻度具刻度或微量移液器及吸头

2.71mL0.01mL10mL0.1mL

:,。

2.8无菌培养皿直径60mm90mm

无菌试管:、。

2.93mm×50mm10mm×75mm

2.10H计或H比色管或精密H试纸。

ppp

2.11全自动微生物生化鉴定系统。

2.12无菌毛细管。

3培养基和试剂

():。

3.1缓冲蛋白胨水BPW见A.1

():。

3.2四硫磺酸钠煌绿TTB增菌液见A.2

():。

3.3亚硒酸盐胱氨酸SC增菌液见A.3

():。

3.4亚硫酸铋BS琼脂见A.4

:。

3.5HE琼脂见A.5

():。

3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐XLD琼脂见A.6

3.7沙门氏菌属显色培养基。

():。

3.8三糖铁TSI琼脂见A.7

、:。

3.9蛋白胨水靛基质试剂见A.8

():。

尿素琼脂见

3.10pH7.2A.9

():。

3.11氰化钾KCN培养基见A.10

:。

3.12赖氨酸脱羧酶试验培养基见A.11

:。

3.13糖发酵管见A.12

():。

3.14邻硝基酚-D半乳糖苷ONPG培养基见A.13

β

:。

3.15半固体琼脂见A.14

1

—

GB4789.42016

:。

3.16丙二酸钠培养基见A.15

沙门氏菌、和诊断血清。

3.17OHVi

3.18生化鉴定试剂盒。

4检验程序

沙门氏菌检验程序见图1。

图沙门氏菌检验程序

1

2

—

GB4789.42016

5操作步骤

5.1预增菌

(),,/

无菌操作称取25mL样品置于盛有225mLBPW的无菌均质杯或合适容器内以8000rmin~

g

/,,

10000rmin均质1min~2min或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中用拍击式均质器拍打

。,,。,/

若样品为液态不需要均质振荡混匀如需调整用无菌或

1min~2minpH1molmLNaOH

。(

调至无菌操作将样品转至锥形瓶或其他合适容器内如均质杯本身具有无

HClH6.8±0.2500mL

p

,),,,。

孔盖可不转移样品如使用均质袋可直接进行培养于36℃±1℃培养8h~18h

,,。

如为冷冻产品应在以下不超过或不超过解冻

45℃15min2℃~5℃18h

5.2增菌

,,,。

轻轻摇动培养过的样品混合物移取1mL转种于10mLTTB内于42℃±1℃培养18h~24h

,,,。

同时另取1mL转种于10mLSC内于36℃±1℃培养18h~24h

5.3分离

,(

分别用直径的接种环取增菌液环划线接种于一个琼脂平板和一个琼脂平板或

3mm1BSXLDHE

),()

琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板于36℃±1℃分别培养40h~48hBS琼脂平板或18h~24h

(、、),,

XLD琼脂平板HE琼脂平板沙门氏菌属显色培养基平板观察各个平板上生长的菌落各个平板

上的菌落特征见表1。

表沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

1

选择性琼脂平板沙门氏菌

、,;

菌落为黑色有金属光泽棕褐色或灰色菌落周围培养基可呈黑色或棕色有些菌株形成灰绿

BS琼脂

,

色的菌落周围培养基不变

,;,

HE琼脂蓝绿色或蓝色多数菌落中心黑色或几乎全黑色有些菌株为黄色中心黑色或几乎全黑色

,,,

菌落呈粉红色带或不带黑色中心有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心或呈现全部黑色

XLD琼脂

;,

的菌落有些菌株为黄色菌落带或不带黑色中心

沙门氏菌属显色培

按照显色培养基的说明进行判定

养基

5.4生化试验

,,,

自选择性琼脂平板上分别挑取个以上典型或可疑菌落接种三糖铁琼脂先在斜面划线再于

5.4.12

;,,

底层穿刺接种针不要灭菌直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板于36℃±1℃培养

,。,

18h~24h必要时可延长至48h在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内沙门氏菌属的反应结

果见表2。

3

—

GB4789.42016

表沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

2

三糖铁琼脂

赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断

斜面底层产气硫化氢

()()可疑沙门氏菌属

KA+-+-+

()()可疑沙门氏菌属

KA+-+--

()()可疑沙门氏菌属

AA+-+-+

//非沙门氏菌

AA+-+--

///非沙门氏菌

KK+-+-+-

::,:;:,:;():,;/:。

注K产碱A产酸+阳性-阴性+-多数阳性少数阴性+-阳性或阴性

,()、

5.4.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时可直接接种蛋白胨水供做靛基质试验

()、(),

尿素琼脂pH7.2氰化钾KCN培养基也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接

。,,。

种于培养必要时可延长至按表判定结果将已挑菌落的平板储存

36℃±1℃18h~24h48h3

,。

于2℃~5℃或室温至少保留24h以备必要时复查

表沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

3

反应序号硫化氢()靛基质尿素氰化钾()赖氨酸脱羧酶

HSH7.2KCN

2p

A1+---+

A2++--+

/

A3----+-

:;;/。

注阳性阴性阳性或阴性

+-+-

:。、

反应序号典型反应判定为沙门氏菌属如尿素和赖氨酸脱羧酶项中有项异

5.4.2.1A1KCN31

,。。

常按表可判定为沙门氏菌如有项异常为非沙门氏菌

42

表沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

4

尿素氰化钾()赖氨酸脱羧酶判定结果

pH7.2KCN

(

甲型副伤寒沙门氏菌要

---

求血清学鉴定结果)

(

沙门氏菌或要求符

ⅣⅤ

-++

合本群生化特性)

(

沙门氏菌个别变体要求

+-+

血清学鉴定结果)

:;。

注表示阳性表示阴性

+-

:,,

5.4.2.2反应序号A2补做甘露醇和山梨醇试验沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性但

需要结合血清学鉴定结果进行判定。

:。,,

5.4.2.3反应序号A3补做ONPGONPG阴性为沙门氏菌同时赖氨酸脱羧酶阳性甲型副伤寒沙

门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

必要时按表进行沙门氏菌生化群的鉴别。

5.4.2.45

4

—

GB4789.42016

表沙门氏菌属各生化群的鉴别

5

项目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ

卫矛醇++——+—

山梨醇+++++—

水杨苷———+——

ONPG——+—+—

丙二酸盐—++———

KCN———++—

:;—。

注+表示阳性表示阴性

,,

5.4.3如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统可根据5.4.1的初步判断结果从营养琼

,,

脂平板上挑取可疑菌落用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生

化鉴定系统进行鉴定。

5.5血清学鉴定

5.5.1检查培养物有无自凝性

。,

一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原首先排除自凝集反应在洁净的

,,,

玻片上滴加一滴生理盐水将待试培养物混合于生理盐水滴内使成为均一性的混浊悬液将玻片轻轻

,(),,

摇动30s~60s在黑色背景下观察反应必要时用放大镜观察若出现可见的菌体凝集即认为有自

,。。

凝性反之无自凝性对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定

()

多价菌体抗原鉴定

5.5.2O

,,/,

在玻片上划出个约的区域挑取环待测菌各放环于玻片上的每一区域上部

21cm×2cm112

(),,。

在其中一个区域下部加滴多价菌体抗血清在另一区域下部加入滴生理盐水作为对照再用

1O1

。,

无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌苔研成乳状液将玻片倾斜摇动混合1min并对着黑暗背

,。,(

景进行观察任何程度的凝集现象皆为阳性反应O血清不凝集时将菌株接种在琼脂量较高的如

);,

培养基上再检查如果是由于抗原的存在而阻止了凝集反应时可挑取菌苔于生

2%~3%ViO1mL

,。

理盐水中做成浓菌液于酒精灯火焰上煮沸后再检查

()

多价鞭毛抗原鉴定

5.5.3H

。,,

操作同5.5.2H抗原发育不良时将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央待菌落

,;

蔓延生长时在其边缘部分取菌检查或将菌株通过接种装有半固体琼脂的小玻管次

0.3%~0.4%1~

,。

2次自远端取菌培养后再检查

()

5.6血清学分型选做项目

5.6.1O抗原的鉴定

,。

用多价血清做玻片凝集试验同时用生理盐水做对照在生理盐水中自凝者为粗糙型菌

A~FO

,。

株不能分型

,;、;;;;。

被多价血清凝集者依次用和因子血清做凝集试验

A~FOO4O3O10O7O8O9O2O11

,。、,、、、

根据试验结果判定群被血清凝集的菌株再用单因子血清做凝集

OO3O10O10O15O34O19

5

—

GB4789.42016

,、,,

试验判定各亚群每一个抗原成分的最后确定均应根据单因子血清的检查结果没有

E1E4OOO

单因子血清的要用两个复合因子血清进行核对。

O

,,,

不被多价血清凝集者先用种多价血清检查如有其中一种血清凝集则用这种血清

A~FO9O

,。:

所包括的群血清逐一检查以确定群每种多价血清所包括的因子如下

OOOO

,,,,,(,)

O多价1ABCDEF群并包括614群

多价,,,,群

O21316171821

多价,,,,群

O32830353839

多价,,,群

O440414243

多价,,,群

O544454748

多价,,,群

O650515253

多价,,,群

O755565758

多价,,,群

O859606162

多价,,,群

O963656667

5.6.2H抗原的鉴定

,。

属于各群的常见菌型依次用表所述因子血清检查第相和第相的抗原

A~FO6H12H

表6A~F群常见菌型H抗原表

群第相第相

O12

Aa无

,,无

Bgfs

,,

Bibd2

,,,,

C1kvrc5z15

,,,

C2bdr25

()

D不产气的d无

(),,,

D产气的m无

gpq

,,,

E1hv6wx

,,无

E4gst

E4i

,,,

不常见的菌型先用种多价血清检查如有其中一种或两种血清凝集则再用这一种或两种血

8H

,。

清所包括的各种因子血清逐一检查以第相和第项的抗原种多价血清所包括的因

H12H8HH

子如下:

多价,,,,

H1abcdi

多价,,,,,,,,,

H2ehenxenzfmsumtz

15gggpgpgqg51

多价,,,,,,,,,

H3krzzlvlwlzlzlz

y10132840

多价,;,;,;,;

H412151617z

6

多价,,,,,,

H5zzzzzzzzzz

42342443229353638

多价,,,

H6zzzz

39414244

多价,,,

H7zzzz

52535455

多价,,,,

H8zzzzz

5657606162

,

每一个抗原成分的最后确定均应根据单因子血清的检查结果没有单因子血清的要用两

HHH

个复合因子血清进行核对。

H

,

检出第相抗原而未检出第相抗原的或检出第相抗原而未检出第相抗原的可

1H2H2H1H

6

—

GB4789.42016

。,

在琼脂斜面上移种代代后再检查如仍只检出一个相的抗原要用位相变异的方法检查其另

1~2H

。。

一个相单相菌不必做位相变异检查

位相变异试验方法如下:

:,,

简易平板法将半固体琼脂平板烘干表面水分挑取因子血清环滴在半固体平板

0.35%~0.4%1

,,,,,

表面放置片刻待血清吸收到琼脂内在血清部位的中央点种待检菌株培养后在形成蔓延生长的菌

苔边缘取菌检查。

:(),

小玻管法将半固体管每管约在酒精灯上溶化并冷至取已知相的因子血

1mL~2mL50℃H

,,,

清0.05mL~0.1mL加入于溶化的半固体内混匀后用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻

,,,。,,

管内待凝固后用接种针挑取待检菌接种于一端将小玻管平放在平皿内并在其旁放一团湿棉花

,,,。

以防琼脂中水分蒸发而干缩每天检查结果待另一相细菌解离后可以从另一端挑取细菌进行检查

,,。

培养基内血清的浓度应有适当的比例过高时细菌不能生长过低时同一相细菌的动力不能抑制一般

按原血清1∶200~1∶800的量加入。

:(,),

小倒管法将两端开口的小玻管下端开口要留一个缺口不要平齐放在半固体管内小玻管的上

,。,,,

端应高出于培养基的表面灭菌后备用临用时在酒精灯上加热溶化冷至挑取因子血清环