GB 4789.6-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验

中华人民共和国国家标准

—

GB4789.62016

食品安全国家标准

食品微生物学检验

致泻大肠埃希氏菌检验

2016-12-23发布2017-06-23实施

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会

发布

国家食品药品监督管理总局

—

GB4789.62016

前言

本标准代替/—《食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》。

GBT4789.62003

/—,:

本标准与GBT4789.62003相比主要变化如下

———“”;

标准名称修改为食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验

———、;

增加了术语和定义缩略语

———增加了血清学试验中抗原鉴定;

H

———增加了PCR确认试验;

———增加了附录A;

———修改了设备和材料;

———修改了培养基和试剂;

———修改了检验程序;

———修改了血清学试验中致泻大肠埃希氏菌所包括的抗原群;

O

———删除了肠毒素试验。

Ⅰ

—

GB4789.62016

食品安全国家标准

食品微生物学检验

致泻大肠埃希氏菌检验

1范围

本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌()的检验方法。

diarrheaenicEscherichiacoli

g

本标准适用于食品中致泻大肠埃希氏菌的检验。

、

2术语和定义缩略语

2.1术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1.1致泻大肠埃希氏菌DiarrheaenicEscherichiacoli

g

,。

一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌可经过污染食物引起人类发病常见的致泻大

、、、

肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌肠道侵袭性大肠埃希氏菌产肠毒素大肠埃希氏菌产

()。

志贺毒素大肠埃希氏菌包括肠道出血性大肠埃希氏菌和肠道集聚性大肠埃希氏菌

2.1.2肠道致病性大肠埃希氏菌EnteroathoenicEscherichiacoli

pg

,。

能够引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤且不产生志贺毒素的大肠埃希氏菌该菌是婴

,,。

幼儿腹泻的主要病原菌有高度传染性严重者可致死

2.1.3肠道侵袭性大肠埃希氏菌EnteroinvasiveEscherichiacoli

。、、

能够侵入肠道上皮细胞而引起痢疾样腹泻的大肠埃希氏菌该菌无动力不发生赖氨酸脱羧反应

,。

不发酵乳糖生化反应和抗原结构均近似痢疾志贺氏菌侵入上皮细胞的关键基因是侵袭性质粒上的

,、()。

抗原编码基因及其调控基因如iaH基因iaR基因又称为invE基因

pp

2.1.4产肠毒素大肠埃希氏菌EnterotoxienicEscherichiacoli

g

/。

能够分泌热稳定性肠毒素或和热不稳定性肠毒素的大肠埃希氏菌该菌可引起婴幼儿和旅游者

,,,。,

腹泻一般呈轻度水样腹泻也可呈严重的霍乱样症状低热或不发热腹泻常为自限性一般2d~3d

即自愈。

2.1.5产志贺毒素大肠埃希氏菌Shiatoxin-roducinEscherichiacoli(肠道出血性大肠埃希氏菌

gpg

EnterohemorrhaicEscherichiacoli)

g

、。

能够分泌志贺毒素引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤的大肠埃希氏菌有些产志贺毒

(),

素大肠埃希氏菌在临床上引起人类出血性结肠炎HC或血性腹泻并可进一步发展为溶血性尿毒综

(),。

合征HUS这类产志贺毒素大肠埃希氏菌为肠道出血性大肠埃希氏菌

1

—

GB4789.62016

2.1.6肠道集聚性大肠埃希氏菌EnteroareativeEscherichiacoli

ggg

,。

肠道集聚性大肠埃希氏菌不侵入肠道上皮细胞但能引起肠道液体蓄积不产生热稳定性肠毒素

,。,

或热不稳定性肠毒素也不产生志贺毒素唯一特征是能对He-2细胞形成集聚性黏附也称He-2

pp

细胞黏附性大肠埃希氏菌。

2.2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

:

2.2.1DEC致泻大肠埃希氏菌DiarrheaenicEscherichiacoli

g

:

2.2.2EPEC肠道致病性大肠埃希氏菌EnteroathoenicEscherichiacoli

pg

:

2.2.3EIEC肠道侵袭性大肠埃希氏菌EnteroinvasiveEscherichiacoli

:

2.2.4ETEC产肠毒素大肠埃希氏菌EnterotoxienicEscherichiacoli

g

:

2.2.5STEC产志贺毒素大肠埃希氏菌Shiatoxin-roducinEscherichiacoli

gpg

:

2.2.6EHEC肠道出血性大肠埃希氏菌EnterohemorrhaicEscherichiacoli

g

:

2.2.7EAEC肠道集聚性大肠埃希氏菌EnteroareativeEscherichiacoli

ggg

:,

2.2.8escV蛋白分泌物调节基因eneencodinLEE-encodedteⅢsecretionsstemfactor

ggypy

:,

2.2.9eae紧密素基因eneencodinintiminforEscherichiacoliattachinandeffacin

gggg

:,;

束状菌毛基因

2.2.10bBBbundle-forminilusB

fpgp

:,

志贺毒素基因

2.2.11stx1ⅠShiatoxinone

g

:,

志贺毒素基因

2.2.12stx2ⅡShiatoxintwo

g

:,

2.2.13lt热不稳定性肠毒素基因heat-labileenterotoxin

:,

2.2.14st热稳定性肠毒素基因heat-stableenterotoxin

():猪源热稳定性肠毒素基因,

2.2.15ststIaheat-stableenterotoxinsinitialldiscoveredinthe

py

isolatesfromis

pg

():人源热稳定性肠毒素基因,

2.2.16sthstIbheat-stableenterotoxinsinitialldiscoveredinthe

y

isolatesfromhuman

:,

2.2.17invE侵袭性质粒调节基因invasivelasmidreulator

pg

:,

侵袭性质粒抗原基因

2.2.18iaHHinvasivelasmidantienH-ene

ppgg

:,

2.2.19aR集聚黏附菌毛调节基因areativeadhesivefimbriaereulator

gggggg

:葡萄糖苷酶基因,

2.2.20uidA--lucuronidaseene

ββgg

:,

集聚热稳定性毒素基因

2.2.21astAAenteroareativeheat-stableenterotoxinA

ggg

:,

2.2.22ic肠定植因子基因proteininvolvedinintestinalcolonization

p

:,

2.2.23LEE肠细胞损伤基因座Locusofenterocteeffacement

y

:黏附因子,

2.2.24EAFEPECEPECadhesivefactor

3设备和材料

,:

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外其他设备和材料如下

恒温培养箱:,。

3.136℃±1℃42℃±1℃

冰箱:。

3.22℃~5℃

恒温水浴箱:,或适配或金属浴()。

3.350℃±1℃100℃1.5mL2.0mL95℃~100℃

:。

3.4电子天平感量为0.1g和0.01g

显微镜:。

3.510×~100×

2

—

GB4789.62016

3.6均质器。

3.7振荡器。

:(),()。

无菌吸管具刻度具刻度或微量移液器及吸头

3.81mL0.01mL10mL0.1mL

:。

3.9无菌均质杯或无菌均质袋容量500mL

:。

3.10无菌培养皿直径90mm

3.11H计或精密H试纸。

pp

微量离心管:或。

3.121.5mL2.0mL

接种环:。

3.131L

μ

:/,。

3.14低温高速离心机转速≥13000rmin控温4℃~8℃

3.15微生物鉴定系统。

3.16PCR仪。

微量移液器及吸头:,,,。

3.170.5L~2L2L~20L20L~200L200L~1000L

μμμμμμμμ

:、、()。

3.18水平电泳仪包括电源电泳槽制胶槽长度>10cm和梳子

(/)。

联排管和联排盖平盖凸盖

3.1988

3.20凝胶成像仪。

4培养基和试剂

:。

4.1营养肉汤见A.1

:。

4.2肠道菌增菌肉汤见A.2

():。

4.3麦康凯琼脂MAC见A.3

():。

4.4伊红美蓝琼脂EMB见A.4

():。

4.5三糖铁TSI琼脂见A.5

、:。

4.6蛋白胨水靛基质试剂见A.6

:。

4.7半固体琼脂见A.7

():。

尿素琼脂见

4.8pH7.2A.8

():。

4.9氰化钾KCN培养基见A.9

:。

4.10氧化酶试剂见A.10

:。

4.11革兰氏染色液见A.11

:。

4.12BHI肉汤见A.12

()。

4.13福尔马林含38%~40%甲醛

4.14鉴定试剂盒。

4.15大肠埃希氏菌诊断血清。

4.16灭菌去离子水。

4.170.85%灭菌生理盐水。

():。

见

4.18TEH8.0A.13

p

:。

4.1910×PCR反应缓冲液见A.14

/。

4.2025mmolLMCl

g2

:、、、每种浓度为/。

4.21dNTPsdATPdTTPdGTPdCTP2.5mmolL

/酶。

4.225ULTa

q

4.23引物。

:。

4.2450×TAE电泳缓冲液见A.15

4.25琼脂糖。

3

—

GB4789.62016

溴化乙锭()或其他核酸染料。

4.26EB

:。

4.276×上样缓冲液见A.16

:、、、、、、、、、

4.28Marker分子量包含100b200b300b400b500b600b700b800b900b

ppppppppp

、条带。

1000b1500b

pp

4.29致泻大肠埃希氏菌PCR试剂盒。

5检验程序

致泻大肠埃希氏菌检验程序见图1。

图1致泻大肠埃希氏菌检验程序

4

—

GB4789.62016

6操作步骤

6.1样品制备

6.1.1固态或半固态样品

,,,

固体或半固态样品以无菌操作称取检样25g加入装有225mL营养肉汤的均质杯中用旋转刀

//;

片式均质器以8000rmin~10000rmin均质1min~2min或加入装有225mL营养肉汤的均质袋

,。

中用拍击式均质器均质1min~2min

6.1.2液态样品

,(

以无菌操作量取检样25mL加入装有225mL营养肉汤的无菌锥形瓶瓶内可预置适当数量的无

),。

菌玻璃珠振荡混匀

6.2增菌

。,,

将6.1制备的样品匀液于36℃±1℃培养6h取10L接种于30mL肠道菌增菌肉汤管内于

μ

42℃±1℃培养18h。

6.3分离

,,。

将增菌液划线接种和琼脂平板于培养观察菌落特征在

MACEMB36℃±1℃18h~24h

,,;

MAC琼脂平板上分解乳糖的典型菌落为砖红色至桃红色不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色在

,,

EMB琼脂平板上分解乳糖的典型菌落为中心紫黑色带或不带金属光泽不分解乳糖的菌落为无色或

淡粉色。

6.4生化试验

(),,

选取平板上可疑菌落个个个以下全选应挑取乳糖发酵以及乳糖不发酵和迟缓

6.4.110~2010

,。、()

发酵的菌落分别接种斜面同时将这些培养物分别接种蛋白胨水尿素琼脂和肉

TSIpH7.2KCN

。。

汤于36℃±1℃培养18h~24h

,,,

6.4.2TSI斜面产酸或不产酸底层产酸靛基质阳性HS阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏

2

。,、、,。

菌TSI斜面底层不产酸或HSKCN尿素有任一项为阳性的培养物均非大肠埃希氏菌必要时

2

。,。

做革兰氏染色和氧化酶试验大肠埃希氏菌为革兰氏阴性杆菌氧化酶阴性

,

6.4.3如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统可从营养琼脂平板上挑取经纯化的可疑菌落用无菌

,。

稀释液制备成浊度适当的菌悬液使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定

6.5PCR确认试验

6.5.1取生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行PCR确认试验。

:、《》(—)

注PCR实验室区域设计工作基本原则及注意事项应参照疾病预防控制中心建设标准建标1272009和国家

()()《》(

卫生和计划生育委员会原卫生部2010医疗机构临床基因扩增管理办法附录医疗机构临床基因扩增检

验实验室工作导则)。

,

6.5.2使用1L接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养18h~24h的菌落悬浮在200L0.85%灭

μμ

,,/,。

菌生理盐水中充分打散制成菌悬液于13000rmin离心3min弃掉上清液加入1mL灭菌去离子

,;,/,

水充分混匀菌体于100℃水浴或者金属浴维持10min冰浴冷却后13000rmin离心3min收集上

;,;

清液按1∶10的比例用灭菌去离子水稀释上清液取2L作为PCR检测的模板所有处理后的DNA

μ

5

—

GB4789.62016

;,(

模板直接用于反应或暂存于并当天进行反应否则应在以下保存备用周

PCR4℃PCR-20℃1

)。