GB/T 4789.4-2008 食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验

犐犆犛０７．１００．３０

犆５３

中华人民共和国国家标准

／—

犌犅犜４７８９．４２００８

代替／—２００３

ＧＢＴ４７８９．４

食品卫生微生物学检验

沙门氏菌检验

国家标准ㅤ可打印ㅤ无水印ㅤ高清原版ㅤ去除空白页

—

犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犻犮犪犾犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犳狅狅犱犺犻犲狀犲

犵狔犵

犈狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犛犪犾犿狅狀犲犾犾犪

２００８０５１６发布２００８１１０１实施

中华人民共和国卫生部

发布

中国国家标准化管理委员会

／—

犌犅犜４７８９．４２００８

前言

本标准参考采用了国际分析家学会（），

ＡＯＡＣＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬＡＯＡＣＯｆｆｉｃｉａｌＭｅｔｈｏｄ９６７．２６

，；国际标准化组织（）：；美国食品药品管理局（）《细菌分析手册》第

９６７．２７９６７．２８ＩＳＯＩＳＯ６５７９２００２ＦＤＡ

章：沙门氏菌（年）（，：犛犪犾犿狅狀犲犾犾犪２００３，）。

５２００３ＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｉｃａｌＡｎａｌｔｉｃａｌＭａｎｕａｌＣｈａｔｅｒ５

ｇｙｐ

本标准代替ＧＢＴ４７８９．４２００３／—《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》。本标准自实施之日

起，／—同时废止。

ＧＢＴ４７８９．４２００３

本标准与ＧＢＴ４７８９．４２００３／—相比主要变化如下：

———规范了样品制备过程；

———修改了原标准中前增菌和增菌部分；

———修改了原标准中分离部分；

———修改了原标准中生化试验部分。

本标准的附录、附录为规范性附录。

ＡＢ

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Ⅰ

／—

犌犅犜４７８９．４２００８

食品卫生微生物学检验

沙门氏菌检验

１范围

本标准规定了食品中沙门氏菌的检验方法。

本标准适用于各类食品和食物中毒样品中沙门氏菌的检验。

２设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。

２．１冰箱：２℃５℃。

～

２．２恒温培养箱：３６℃±１℃４２℃±１℃，。

２．３均质器。

２．４振荡器。

２．５电子天平：感量０．１。

ｇ

２．６无菌锥形瓶：容量５００ｍＬ２５０ｍＬ，。

无菌吸管：（具刻度）、（具刻度）或微量移液器及吸头。

２．７１ｍＬ０．０１ｍＬ１０ｍＬ０．１ｍＬ

２．８无菌培养皿：直径９０ｍｍ。

无菌试管：、国家标准ㅤ可打印ㅤ无水印ㅤ高清原版ㅤ去除空白页。

２．９３ｍｍ×５０ｍｍ１０ｍｍ×７５ｍｍ

２．１０无菌毛细管。

计或比色管或精密试纸。

２．１１ＨＨＨ

ｐｐｐ

全自动微生物鉴定系统（）１）。

２．１２ＶＩＴＥＫ

３培养基和试剂

缓冲蛋白胨水（）：见第章。

３．１ＢＰＷＡ．１

四硫磺酸钠煌绿（）增菌液：见第章。

３．２ＴＴＢＡ．２

亚硒酸盐胱氨酸（）增菌液：见第章。

３．３ＳＣＡ．３

３．４亚硫酸铋（）琼脂：见第章。

ＢＳＡ．４

（）琼脂：见第章。

３．５ＨＥＨｅｋｔｏｅｎＥｎｔｅｒｉｃＡ．５

木糖赖氨酸脱氧胆盐（）琼脂：见第章。

３．６ＸＬＤＡ．６

３．７科玛嘉沙门氏菌属显色培养基２）。

三糖铁（）琼脂：见第章。

３．８ＴＳＩＡ．７

３．９蛋白胨水、靛基质试剂：见第Ａ．８章。

３．１０尿素琼脂（Ｈ７．２）：见第Ａ．９章。

ｐ

氰化钾（）培养基：见第章。

３．１１ＫＣＮＡ．１０

３．１２赖氨酸脱羧酶试验培养基：见第Ａ．１１章。

１）由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品

的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。

２）由法国科玛嘉公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认

可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。

１

／—

犌犅犜４７８９．４２００８

３．１３糖发酵管：见第Ａ．１２章。

邻硝基酚半乳糖苷（）培养基：见第章。

３．１４ＤＯＮＰＧＡ．１３

β

３．１５半固体琼脂：见第Ａ．１４章。

３．１６丙二酸钠培养基：见第Ａ．１５章。

沙门氏菌和诊断血清。

３．１７ＯＨ

＋１）

３．１８ＡＰＩ２０Ｅ生化鉴定试剂盒或ＶＩＴＥＫＧＮＩ生化鉴定卡。

４检验程序

沙门氏菌检验程序见图。１

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图１沙门氏菌检验程序

２

／—

犌犅犜４７８９．４２００８

５操作步骤

５．１前增菌

称取（）样品放入盛有的无菌均质杯中，以／／均质

２５ｍＬ２２５ｍＬＢＰＷ８０００ｒｍｉｎ１００００ｒｍｉｎ

ｇ～

１ｍｉｎ２ｍｉｎ，或置于盛有２２５ｍＬＢＰＷ的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ２ｍｉｎ。若样品

～～

为液态，不需要均质，振荡混匀。如需要，测定ｐＨ值，用１ｍｏｌｍＬ／无菌氢氧化钠或盐酸调ｐＨ至

６．８±０．２。无菌操作将样品转至５００ｍＬ锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于３６℃±１℃培养

８ｈ１８ｈ。

～

如为冷冻产品，应在以下不超过，或不超过解冻。

４５℃１５ｍｉｎ２℃５℃１８ｈ

～

５．２增菌

轻轻摇动培养过的样品混合物，移取１ｍＬ，转种于１０ｍＬＴＴＢ内，于４２℃±１℃培养１８ｈ２４ｈ。

～

同时，另取１ｍＬ，转种于１０ｍＬＳＣ内，于３６℃±１℃培养１８ｈ２４ｈ。

～

５．３分离

分别用接种环取增菌液环，划线接种于一个琼脂平板和一个琼脂平板（或琼脂平

１ＢＳＸＬＤＨＥ

板或科玛嘉显色培养基平板）。于分别培养（琼脂平板、琼脂平板、科玛

３６℃±１℃１８ｈ２４ｈＸＬＤＨＥ

～

嘉显色培养基平板）或（琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特

４０ｈ４８ｈＢＳ

～

征见表。１

表１沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性琼脂平板沙门氏菌

菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰

ＢＳ琼脂国家标准ㅤ可打印ㅤ无水印ㅤ高清原版ㅤ去除空白页

绿色的菌落，周围培养基不变

蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全

ＨＥ琼脂

黑色

菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑

ＸＬＤ琼脂

色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心

科玛嘉显色培养基菌落为紫红色

５．４生化试验

５．４．１自选择性琼脂平板上分别挑取两个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于

底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于３６℃±１℃培养

１８ｈ２４ｈ，必要时可延长至４８ｈ。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应

～

结果见表。２

表沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

２

三糖铁琼脂

赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断

斜面底层产气硫化氢

（）（）可疑沙门氏菌属

－＋＋－＋－＋

（）（）可疑沙门氏菌属

－＋＋－＋－－

（）（）可疑沙门氏菌属

＋＋＋－＋－＋

＋＋＋－／＋－／－非沙门氏菌

注：阳性，阴性；（）多数阳性，少数阴性；／阳性或阴性。

＋－＋－＋－

３

／—

犌犅犜４７８９．４２００８

表说明，在三糖铁琼脂内斜面产酸，底层产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除。其２

他的反应结果均有沙门氏菌属的可能，同时也均有不是沙门氏菌属的可能。

５．４．２接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、

尿素琼脂（）、氰化钾（）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接

ｐＨ７．２ＫＣＮ

种。于３６℃±１℃培养１８ｈ２４ｈ，必要时可延长至４８ｈ，按表判定结果。将已挑菌落的平板储存３

～

于２℃５℃或室温至少保留２４ｈ，以备必要时复查。

～

表３沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

硫化氢氰化钾

反应序号靛基质ｐＨ７．２尿素赖氨酸脱羧酶

（ＨＳ）（）

２ＫＣＮ

Ａ１＋－－－＋

Ａ２＋＋－－＋

Ａ３－－－－＋／－

注：阳性；阴性；／阳性或阴性。

＋－＋－

反应序号：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶项中有项异

５．４．２．１Ａ１３１

常，按表可判定为沙门氏菌。如有项异常为非沙门氏菌。４２

表４沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

赖氨酸

尿素氰化钾（）判定结果

Ｈ７．２ＫＣＮ

ｐ

脱羧酶

－－－甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）

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－＋＋沙门氏菌或（要求符合本群生化特性）

ⅣⅤ

＋－＋沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）

注：表示阳性；表示阴性。

＋＋

反应序号：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，

５．４．２．２Ａ２

但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

反应序号：补做。阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒沙

５．４．２．３Ａ３ＯＮＰＧＯＮＰＧ

门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

５．４．２．４必要时按表进行沙门氏菌生化群的鉴别。

５

表５沙门氏菌属各生化群的鉴别

项目

ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ

卫矛醇＋＋－－＋－

山梨醇＋＋＋＋＋－

水杨苷－－－＋－－

ＯＮＰＧ－－＋－＋－

丙二酸盐－＋＋－－－

氰化钾（）

ＫＣＮ－－－＋＋－

注：表示阳性；表示阴性。

＋－

５．４．３如选择ＡＰＩ２０Ｅ生化鉴定试剂盒或ＶＩＴＥＫ全自动微生物鉴定系统，可根据５．４．１的初步判断

结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用ＡＰＩ２０Ｅ生化鉴定

试剂盒或ＶＩＴＥＫ全自动微生物鉴定系统进行鉴定。

４

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５．５血清学鉴定

５．５．１抗原的准备

一般采用１．２％１．５％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

～

血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如）培养基上再检查；如果是由于抗

Ｏ２％３％Ｖｉ

～

原的存在而阻止了凝集反应时，可挑取菌苔于生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸

Ｏ１ｍＬ

后再检查。Ｈ抗原发育不良时，将菌株接种在０．５５％０．６５％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生

～

长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有０．３％０．４％半固体琼脂的小玻管次１２次，自远

～～

端取菌培养后再检查。

多价菌体抗原（）鉴定

５．５．２犗

在玻片上划出两个约的区域，挑取环待测菌，各放／环于玻片上的每一区域上部，

１ｃｍ×２ｃｍ１１２

在其中一个区域下部加滴多价菌体（）抗血清，在另一区域下部加入滴生理盐水，作为对照。再用

１Ｏ１

无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合１ｍｉｎ，并对着黑暗背

景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

多价鞭毛抗原（）鉴定

５．５．３犎

同５．５．２。

５．５．４血清学分型（选做项目）

５．５．４．１犗抗原的鉴定

用多价血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌

ＡＦＯ

～

株，不能分型。

被多价血清凝集者，依次用；、；；；；和因子血清做凝集试验。

ＡＦＯＯ４Ｏ３Ｏ１０Ｏ７Ｏ８Ｏ９Ｏ２Ｏ１１

～

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根据试验结果，判定群。被、血清凝集的菌株，再用、、、单因子血清做凝集

ＯＯ３Ｏ１０Ｏ１０Ｏ１５Ｏ３４Ｏ１９

试验，判定、、、各亚群，每一个抗原成分的最后确定均应根据单因子血清的检查结果，

Ｅ１Ｅ２Ｅ３Ｅ４ＯＯ

没有单因子血清的要用两个复合因子血清进行核对。

ＯＯ

不被多价血清凝集者，先用种多价血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血

ＡＦＯ９Ｏ

～

清所包括的群血清逐一检查，以确定群。每种多价血清所包括的因子如下：

ＯＯＯＯ

多价，，，，，群（并包括，群）

Ｏ１ＡＢＣＤＥＦ６１４

多价，，，，群

Ｏ２１３１６１７１８２１

多价，，，，群

Ｏ３２８３０３５３８３９

多价，，，群

Ｏ４４０４１４２４３

多价，，，群

Ｏ５４４４５４７４８

多价，，，群

Ｏ６５０５１５２５３

多价，，，群

Ｏ７５５５６５７５８

多价，，，群

Ｏ８５９６０６１６２

多价，，，群

Ｏ９６３６５６６６７

５．５．４．２犎抗原的鉴定

属于各群的常见菌型，依次用表所述因子血清检查第相和第相的抗原。

ＡＦＯ６Ｈ１２Ｈ

～

表群常见菌型抗原表

６犃犉犎

～

Ｏ群第相１第相２

Ａａ无

，，无

Ｂｇｆｓ

，，

Ｂｉｂｄ２

５

／—

犌犅犜４７８９．４２００８

表（续）

６

Ｏ群第相１第相２

，，，，

Ｃ１ｋｖｒｃ５Ｚ１５

，，，

Ｃ２ｂｄｒ２５

Ｄ（不产气的）ｄ无

（产气的），，，无

Ｄｍ

ｇｐｑ

，，，

Ｅ１ｈｖ６ｗｘ

，，无

Ｅ４ｇｓｔ

Ｅ４ｉ无

不常见的菌型，先用种多价血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种

８Ｈ

血清所包括的各种因子血清逐一检查，以第相和第项的抗原。种多价血清所包括的

Ｈ１２Ｈ８ＨＨ

因子如下：

多价，，，，

Ｈ１ａｂｃｄｉ

Ｈ多价２ｅｈｅｎｘｅｎｚ，，，，，，，，，

ｆｍｓｕｍｔｚ

１５ｇｇｇｐｇｐｇｑｇ５１

多价，，，，，，，，，

Ｈ３ｋｒｚｚｌｖｌｗｌｚｌｚｌｚ

ｙ１０１３２８４０

多价，；，；，；，；

Ｈ４１２１５１６１７ｚ

６

Ｈ多价５ｚｚｚｚ，，，，，，

ｚｚｚｚｚｚ

４２３４２４４３２２９３５３６３８

Ｈ多价６ｚ，，，

ｚｚｚ

３９４１４２４４

多价，，，

Ｈ７ｚｚｚｚ

５２５３５４５５

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Ｈ多价８ｚ，，，，

ｚｚｚｚ

５６５７６０６１６２

每一个抗原成分的最后确定均应根据单因子血清的检查结果，没有单因子血清的要用两

ＨＨＨ

个复合因子血清进行核对。

Ｈ

检出第相抗原而未检出第相抗原的或检出第相抗原而未检出第相抗原的，可

１Ｈ２Ｈ２Ｈ１Ｈ

在琼脂斜面上移种代１～２代后再检查。如仍只检出一个相的Ｈ抗原，要用位相变异的方法检查其另

一个相。单相菌不必做位相变异检查。

位相变异试验方法如下：

小玻管法：将半固体管（每管约１ｍＬ２ｍＬ）在酒精灯上熔化并冷至５０℃，取已知相的Ｈ因子

～

血清０．０５ｍＬ０．１ｍＬ，加入于熔化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的

～

小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团

湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌

进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不

能抑制。一般按原血清１∶２００１∶８００的量加入。

～

小倒管法：将两端开口的小玻管（下端开口要留一个缺口，不要平齐）放在半固体管内，小玻管的

上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热熔化，冷至５０℃，挑取因子血清

１环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固

体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种软琼

１％

脂斜面，于３７℃培养后再做凝集试验。

简易平板法：将０．７％０．８％半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清环，滴在半固体平１

～

板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长

的菌苔边缘取菌检查。

６

／—

犌犅犜４７８９．４２００８

５．５．４．３犞犻抗原的鉴定

用因子血清检查。已知具有抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林沙

ＶｉＶｉ

门氏菌。

５．５．４．４菌型的判定

根据血清学分型鉴定的结果，按照附录或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。Ｂ

５．６结果报告

综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告２５ｇ样品中检出或未检出沙门氏菌属。

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７

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附录犃

（规范性附录）

培养基和试剂

缓冲蛋白胨水（）

犃．１犅犘犠

犃．１．１成分

蛋白胨１０．０ｇ

氯化钠５．０ｇ

磷酸氢二钠（含个结晶水）

１２９．０ｇ

磷酸二氢钾１．５ｇ

蒸馏水１０００．０ｍＬ

犃．１．２制备

将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约１０ｍｉｎ，