GB/T 4789.34-2003 食品卫生微生物学检验 双歧杆菌检验

GB/T4789.34-2003

前言

本标准的附录A、附录B是规范性附录。

本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。

本标准起草单位:中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、北京市卫生防疫站。

本标准主要起草人:杨宝兰、冉陆、李志刚、王淑真、杨大进、贾珍珍。

GB/T4789.34-2003

食品卫生微生物学检验

双歧杆菌检验

范围

本标准规定了双歧杆菌的检验方法。

本标准适用于食品中双歧杆菌的检验。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，随后所有的

修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是

否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T4789.28-2003食品卫牛微生物学检验染色法、培养基和试剂

术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1

双歧杆菌Bifidobacterium

一群能分解葡萄糖，产生大量乙酸和乳酸，厌氧，不耐酸，不形成芽胞，不运动，细胞呈现多样形态的

革兰氏阳性杆菌。

3.2

双歧杆菌菌落计数enumerationofBifidobacterium

在一定条件培养后，所得1m以g)检样中所含双歧杆菌菌落数。

4设备和材料

4.1恒温培养箱:36℃士10C。

4.2恒温水浴锅:46℃士1'C。

4.3显微镜:lox一100Xo

4.4厌氧培养装置:厌氧罐、厌氧箱。

4.5离心机:3000r/min,

4.6气相色谱仪:(具有氢火焰检测器FID).

4.7架盘药物天平:。g-500g，精度。.5g,

4.8灭菌吸管:1ML(具0.01刻度),10mL(具0.1刻度)。

4.9灭菌平皿:直径90mm.

4.10广口瓶或锥形瓶:300mL,500mL.

5培养基和试剂

5.10.85%灭菌生理盐水。

5.2TPY琼脂培养基:见第A.3章。

5.3BI琼脂培养基:见第A.2章。

GB/T4789.34-2003

5.4BBL琼脂培养基:见第A.1章

5.5双歧杆菌生化用基础培养基:见第A.4章。

5.6PYG液体培养基:见第A.5章。

5.7革兰氏染色液:按GB/T4789.28-2003中2.2规定。

5.8灭菌液体石蜡

5，9甲醇:分析纯

5.10三氯甲烷:分析纯。

5.11硫酸:分析纯。

5.12冰乙酸:分析纯。

5.13乳酸:分析纯。

5.14乙酸标准溶液:吸取分析纯冰乙酸5.7mL，移人100ml一容量瓶中.加水至刻度，标定，标定方法

见附录B，此溶液浓度约为1mot/L.

5.15乙酸标准使用液:将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至。.01-01/1-

5.16乳酸标准溶液:吸取分析纯乳酸8.4m工，移人100ml，容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见

附录B，此溶液浓度约为1mol/L

5.17乳酸标准使用液:将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mot/l_

6检验程序

检验程序见图

分纯革兰氏染色，过氧化氢阵试验

菌落计数报告

接种we庆氧培养

A7'C}72h

测定乙酸、乳酸

菌种鉴定报告

图1

操作步骤

7.1以无菌操作将充分棍匀的检样25g(mL)放人含有225mL灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内作成

GB/T478934一2003

1，1。的均匀稀释液

7.2用lmL灭菌吸管吸取1，01稀释液lm工，沿管壁徐徐注人含有gml灭菌生理盐水的试管内，

振摇混匀，做成1‘01。的稀释液。

7.3另取lml一灭菌吸管，按上述操作顺序，作01倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支lmL

灭菌吸管。

7.4选择2个一3个以上适宜稀释度，分别在作01倍递增稀释的同时，各取。.1，试分别加人计数培

养基平皿，均匀涂布，每个稀释度作两个平皿。最好同时选用2种一3种培养基(B工、B3II、r‘PY培养

基)，同时作灭菌生理盐水空白对照。

7.5待琼脂表面干后，翻转平皿，放至厌氧罐内.操作全过程须在2Omln内完成

7.6将厌养罐置63℃士1℃温箱内培养27h士3h，观察双歧杆菌菌落特征见表1。选取菌落数在3。~

03。之间的平板对可疑菌落进行计数，随机挑取五个可疑菌落进行革兰氏染色、显微镜检查和过氧化氢

酶试验过氧化氢酶阴性，革兰氏染色阳性、无芽胞、着色不均匀、出现“Y’，或“V”型的分叉状、或棒状

等多形态的杆菌可定为双歧杆菌。

表1双歧杆菌在不同培养基上菌落生长形态特征

培养基双歧杆菌特征

BI培养基为黄色菌落中等大小，表面光亮，边缘整齐呈瓷白色、奶油色，质地柔软、细腻

BBI，培养基为黄色菌落中等大小，表面光滑、凸起，边缘整齐呈奶油色，质地柔软、细腻

TPY培养基为黄色菌落表面光滑，凸起，边缘整齐呈奶油色、瓷白色，质地柔软、细腻

7.7菌落计数:根据证实为双歧杆菌的菌落数，计算出平皿内的双歧杆菌数，然后乘以样品的稀释倍

数，得每毫升样品中双歧杆菌数。取三种培养基中计数最高的为最终结果例如，检样1只014倍的稀

释液在BBI琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴