GB 4789.12-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验

中华人民共和国国家标准

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GB4789.122016

食品安全国家标准

食品微生物学检验

肉毒梭菌及肉毒毒素检验

2016-12-23发布2017-06-23实施

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会

发布

国家食品药品监督管理总局

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GB4789.122016

前言

本标准代替/—《食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验》。

GBT4789.122003

/—,:

本标准与GBT4789.122003相比主要变化如下

———“”;

标准名称修改为食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验

———增加了PCR鉴定方法;

———增加了结果与报告;

———增加了附录A;

———修改了设备和材料;

———修改了培养基和试剂;

———修改了检验程序;

———规范了样品制备过程;

———修改了操作步骤中增菌和分离培养部分试验方法。

Ⅰ

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GB4789.122016

食品安全国家标准

食品微生物学检验

肉毒梭菌及肉毒毒素检验

1范围

本标准规定了食品中肉毒梭菌()及肉毒毒素()的检验

Clostridiumbotulinumbotulinumtoxin

方法。

本标准适用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的检验。

2设备和材料

,:

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外其他设备和材料如下

冰箱:、。

2.12℃~5℃-20℃

:。

2.2天平感量0.1g

、、。

2.3无菌手术剪镊子试剂勺

2.4均质器或无菌乳钵。

离心机:/、/。

2.53000rmin14000rmin

2.6厌氧培养装置。

恒温培养箱:、。

2.735℃±1℃28℃±1℃

恒温水浴箱:、、。

2.837℃±1℃60℃±1℃80℃±1℃

:。

显微镜倍倍

2.910~100

2.10PCR仪。

2.11电泳仪或毛细管电泳仪。

2.12凝胶成像系统或紫外检测仪。

2.13核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

可调微量移液器:、、、。

2.140.2L~2L2L~20L20L~200L100L~1000L

μμμμμμμμ

无菌吸管:、、。

2.151.0mL10.0mL25.0mL

无菌锥形瓶:。

2.16100mL

:。

2.17培养皿直径90mm

离心管:、。

2.1850mL1.5mL

2.19PCR反应管。

无菌注射器:。

2.201.0mL

:,。

小鼠每一批次试验应使用同一品系的或小鼠

2.2115~20KMICR

gg

3培养基和试剂

,,/

除另有规定外PCR试验所用试剂为分析纯或符合生化试剂标准水应符合GBT6682中一级水

的要求。

1

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GB4789.122016

:。

3.1庖肉培养基见A.1

():。

3.2胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉汤TPGYT见A.2

:。

3.3卵黄琼脂培养基见A.3

:。

3.4明胶磷酸盐缓冲液见A.4

:。

3.5革兰氏染色液见A.5

:。

3.610%胰蛋白酶溶液见A.6

():。

3.7磷酸盐缓冲液PBS见A.7

/氢氧化钠溶液。

3.81molL

/盐酸溶液。

3.91molL

3.10肉毒毒素诊断血清。

3.11无水乙醇和95%乙醇。

/溶菌酶溶液。

3.1210mmL

g

/蛋白酶溶液。

3.1310mmLK

g

/乙酸钠溶液()。

3.143molLpH5.2

3.15TE缓冲液。

:,/。

引物根据表中序列合成临用时用超纯水配制引物浓度为

3.16110molL

μ

3.1710×PCR缓冲液。

/。

3.1825mmolLMCl

g2

:、、、。

3.19dNTPsdATPdTTPdCTPdGTP

3.20Taq酶。

:。

3.21琼脂糖电泳级

3.22溴化乙锭或Goldview。

3.235×TBE缓冲液。

3.246×加样缓冲液。

3.25DNA分子量标准。

4检验程序

肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序见图1。

2

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GB4789.122016

图1肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序

5操作步骤

5.1样品制备

5.1.1样品保存

待检样品应放置2℃~5℃冰箱冷藏。

5.1.2固态与半固态食品

,,,

固体或游离液体很少的半固态食品以无菌操作称取样品25g放入无菌均质袋或无菌乳钵块状

,,、

食品以无菌操作切碎含水量较高的固态食品加入25mL明胶磷酸盐缓冲液乳粉牛肉干等含水量低

3

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GB4789.122016

,,

的食品加入50mL明胶磷酸盐缓冲液浸泡30min用拍击式均质器拍打2min或用无菌研杵研磨制

,。

备样品匀液收集备用

5.1.3液态食品

,。

液态食品摇匀以无菌操作量取25mL检验

5.1.4剩余样品处理

,,

取样后的剩余样品放2℃~5℃冰箱冷藏直至检验结果报告发出后按感染性废弃物要求进行无

,。

害化处理检出阳性的样品应采用压力蒸汽灭菌方式进行无害化处理

5.2肉毒毒素检测

5.2.1毒素液制备

,/,

取样品匀液约40mL或均匀液体样品25mL放入离心管3000rmin离心10min~20min收集

,,。

上清液分为两份放入无菌试管中一份直接用于毒素检测一份用于胰酶处理后进行毒素检测液体样

,,。

品保留底部沉淀及液体约12mL重悬制备沉淀悬浮液备用

://,

胰酶处理用氢氧化钠或盐酸调节上清液至按份上清液加份

1molL1molLpH6.29110%

(),,,。

胰酶活力1∶250水溶液混匀37℃孵育60min期间间或轻轻摇动反应液

5.2.2检出试验

,,

用号针头注射器分别取离心上清液和胰酶处理上清液腹腔注射小鼠只每只观察和

530.5mL

。,,

记录小鼠48h内的中毒表现典型肉毒毒素中毒症状多在24h内出现通常在6h内发病和死亡其

、,,、、,,

主要表现为竖毛四肢瘫软呼吸困难呈现风箱式呼吸腰腹部凹陷宛如峰腰多因呼吸衰竭而死亡

。,,

可初步判定为肉毒毒素所致若小鼠在24h后发病或死亡应仔细观察小鼠症状必要时浓缩上清液

,。(),

重复试验以排除肉毒毒素中毒若小鼠出现猝死30min内导致症状不明显时应将毒素上清液进

,。

行适当稀释重复试验

:《》。

注毒素检测动物试验应遵循食品安全国家标准食品毒理学实验室操作规范的规定

GB15193.2

5.2.3确证试验

(),,,

上清液或和胰酶处理上清液的毒素试验阳性者取相应试验液份每份其中第一份加

30.5mL

,,;,

等量多型混合肉毒毒素诊断血清混匀37℃孵育30min第二份加等量明胶磷酸盐缓冲液混匀后煮

;,。,

沸10min第三份加等量明胶磷酸盐缓冲液混匀将三份混合液分别腹腔注射小鼠各两只每只

,。

0.5mL观察96h内小鼠的中毒和死亡情况

:,,

结果判定若注射第一份和第二份混合液的小鼠未死亡而第三份混合液小鼠发病死亡并出现肉

,。

毒毒素中毒的特有症状则判定检测样品中检出肉毒毒素

()

5.2.4毒力测定选做项目

,,、、、

取确证试验阳性的试验液用明胶磷酸盐缓冲液稀释制备一定倍数稀释液如倍倍倍

1050100

,,,,

500倍等分别腹腔注射小鼠各两只每只0.5mL观察和记录小鼠发病与死亡情况至96h计算最低

(//),,

致死剂量或评估样品中肉毒毒素毒力等于小鼠全部死亡的最高稀释倍数

MLDmLMLDgMLD

。,