GB 5009.206-2016 食品安全国家标准 水产品中河豚毒素的测定

中华人民共和国国家标准

—

GB5009.2062016

食品安全国家标准

水产品中河豚毒素的测定

2016-12-23发布2017-06-23实施

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会

发布

国家食品药品监督管理总局

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GB5009.2062016

前言

/—《》、/—

本标准代替水产品中河豚毒素的测定液相色谱荧光检测法

GBT232172008-GBT5009.206

《》/—《

鲜河豚鱼中河豚毒素的测定和出口河豚鱼中河豚毒素检测方法第部

2007SNT1569.220132

:》。

分小鼠生物法

/—,:

本标准与GBT5009.2062007相比主要变化如下

———“”;

标准名称修改为食品安全国家标准水产品中河豚毒素的测定

———增加了净化步骤;

———修改了酶联免疫吸附法。

Ⅰ

—

GB5009.2062016

食品安全国家标准

水产品中河豚毒素的测定

1范围

本标准规定了水产品中河豚毒素的测定方法。

、、。

本标准第一法适用于河豚鱼肌肉肝脏皮肤和性腺组织中河豚毒素的测定第二法适用于河豚鱼

、、。、、、、

肌肉肝脏皮肤和性腺组织中河豚毒素的测定第三法适用于河豚鱼织纹螺虾牡蛎花蛤和鱿鱼中

。、、。

河豚毒素的测定第四法适用于河豚鱼肌肉肝脏皮肤和性腺组织中河豚毒素的测定

第一法小鼠生物法

2原理

,(),

根据河豚毒素易溶于酸性溶液原理试样制备后经两次乙酸溶液0.5%煮沸提取20000g离心

,,。

收集上清液将两次上清液合并定容至25mL用于小鼠生物试验根据小鼠注射试样提取液后的死亡

,,,。

时间查出鼠单位并按小鼠体重校正鼠单位计算确定河豚毒素含量

3试剂和材料

,,。

除非另有说明本方法所用试剂均为分析纯实验用水为GB6682规定的三级水

3.1试剂

冰乙酸()。

3.1.1CHCOOH

3

氢氧化钠()。

3.1.2NaOH

3.2试剂配制

():。

3.2.1乙酸溶液0.5%将5mL冰乙酸用水稀释至1L

(/):。

3.2.2氢氧化钠溶液1molL将40g氢氧化钠用水溶解并定容至1000mL

3.3标准品

(,:),,

河豚毒素号纯度或经国家认证并授予标准物质证书的标

CHNOCAS4368-28-9≥98%

111738

准物质。

3.4实验动物

:,()。

小白鼠体重19.0~21.0无特定病原体级SPF昆明系雄性健康小鼠

gg

4仪器和设备

均质器:/。

4.1≥12000rmin

1

—

GB5009.2062016

:。

4.2电子天平感量0.1g

:。

4.3离心机离心力≥30000g

4.4秒表。

5分析步骤

:,。、

注为避免毒素的危害应戴手套进行检验操作移液器吸头等用过的器材废弃的提取液等应在氢氧化钠溶液

(/),。

1molL中浸泡1h以上以使毒素分解

5.1试样制备

5.1.1冷冻河豚鱼样品

。,,、

将样品装于密封塑料袋内于自来水水流下快速解冻解冻后用水洗净用滤纸吸干分解成肌肉

、。,。

肝脏皮肤等部分分别称量后将各组织剪碎充分均质

5.1.2新鲜河豚鱼样品

,、、,,

将样品用水洗净后用滤纸吸干分解成肌肉肝脏皮肤等部分分别称量后将各组织剪碎充分

均质。

5.2试样提取

5.2.1肌肉组织试样

(),(),,

准确称取试样10g精确至0.1g于50mL离心管中加入乙酸溶液0.5%11mL充分混匀沸

,。,,

水浴中煮沸10min不断搅拌以防止组织结块冷却至室温20000g高速离心20min移取上清液于

。(),,,

25mL容量瓶中向沉淀中加入乙酸溶液0.5%11mL充分混匀沸水浴中煮沸5min不断搅拌以防

。,,。,,

止组织结块冷却至室温20000g高速离心20min移取上清液合并上清液混匀用乙酸溶液

()定容至。此提取液相当于试样。

0.5%25mL1mL0.4g

5.2.2肝脏组织试样

(),(),,

准确称取10g精确至0.1g试样于50mL离心管中加入乙酸溶液0.5%8mL充分混匀室温

,。()

下20000g高速离心20min移取上清液于25mL容量瓶中用8mL乙酸溶液0.5%重复提取

。,,()。。

1次合并上清液混匀用乙酸溶液0.5%定容至25mL此提取液1mL相当于0.4g试样

5.2.3皮肤组织试样

(),(),,

准确称取10g精确至0.1g试样于50mL离心管中加入乙酸溶液0.5%11mL充分混匀室

,。()

温下20000g高速离心20min移取上清液于25mL容量瓶中用11mL乙酸溶液0.5%重复提取

。,()。。

1次合并上清液用乙酸溶液0.5%定容至25mL此提取液1mL相当于0.4g试样

:,。,,。

注试样制备时冷冻样品需在半解冻状态下进行操作试样若不能及时检验应于保存在内检验

14℃24h

:,,

注如果河豚鱼样品的脏器或者组织不足的情况下按照以上方法进行提取操作需适量减少乙酸溶液

210g

()的加入量。

0.5%

:、。

注提取液中应不含有离心分离液表面上被分离出来的油状物胶状物或者脂质类

3

5.3小鼠试验

(),。

选取的无特定病原体级昆明系雄性健康小鼠只称量并记录体重随机分

19.0~21.0SPF6

gg

2

—

GB5009.2062016

,。

为实验组和空白对照组两组每组只对每只试验小鼠腹腔注射试样提取液或乙酸溶液

31mL

()()。,,。

0.5%空白对照液若注射过程中注射液溢出须将该只小鼠丢弃并重新注射一只小鼠记录注

,()。

射开始和完毕时间仔细观察并记录小鼠停止呼吸时的死亡时间到小鼠呼出最后一口气止

,,

若注射试样提取液后小鼠死亡时间小于则按附录中表计算出试样提取液的

7minAA.11mL

,,,()

毒力以此为基准配制出使小鼠在7min~13min死亡所需的稀释液采用乙酸溶液0.5%进行稀

,。。,

释将稀释液再注射至少只小鼠以确定试样的毒力具体示例见附录若注射试样溶液后小鼠的

3B

,。

死亡时间大于或等于7min则直接根据中位数致死时间确定试样的毒力

:,,,,

小鼠中毒死亡症状被注射了河豚毒素的小鼠初期安静随后出现呼吸困难急促腹部收缩加快

,,,,,,,

反应迟钝继而出现突然疾走急跑急跳四处乱窜东倒西歪翻转乱跳等挣扎动作数十秒后小鼠后

,,,。

腿剧烈抽搐2~3次后爬卧不动腹部呼吸逐渐微弱减慢最后死亡以停止呼吸作为判断死亡的

标准。

6分析结果的表述

6.1毒力的计算

,,(

根据小鼠试验中得到的小鼠致死时间计算出中位数致死时间然后按表A.1计算出毒力若中位

,;

数致死时间刚好处于表A.1中给出的两时间中间时则取两时间中较大的时间值若介于表A.1中给

,)。

出的两时间中但不正好处于中间时则取更接近于中位数致死时间的时间值若小鼠体重不正好为

,(),。

20.0g则按表A.2对鼠单位MU进行校正通过校正后的鼠单位表示出提取液的毒力

(),

1MU的定义为使体重为20.0g的无特定病原体级SPF昆明系雄性小鼠30min死亡的毒力相

当于0.18μg河豚毒素。

():

试样中河豚毒素的含量按式计算

1

…………()

XMEW1

=×××

f

式中:

———,(/);

X试样中河豚毒素的含量单位为鼠单位每克MUg

———,();

M1mL注射液的鼠单位数单位为鼠单位MU

———,;

E提取系数本方法提取系数为3.11

f———试样提取液的稀释倍数;

W———小鼠体重校正系数。

6.2结果报告

,:

在空白对照组小鼠正常的情况下河豚鱼各组织中河豚毒素含量进行如下判断和表述

,///。

若小鼠的死亡时间大于30min结果报告为<3.11MUg肌肉组织肝脏皮肤

,(),

若小鼠的死亡时间小于结果按式计算得到实际结果报告待测样品中河豚毒素含量为

30min1

///。

×××MUg肌肉组织肝脏皮肤

,,

若只小鼠死亡时间不都小于或不都大于则需重新注射只小鼠以确保只小

330min30min33

,;

鼠死亡时间都小于或都大于结果据此判定若重复注射只小鼠死亡时间仍出现第一

30min30min3

,。

次小鼠死亡情况则需根据第一次注射只小鼠的中位数致死时间判定结果

3

7其他

本方法的检出限为3.11MU/。

g

3

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GB5009.2062016

第二法液相色谱串联质谱法

-

8原理

,,,。

试样经乙酸甲醇溶液提取免疫亲和柱净化液相色谱串联质谱法测定外标法定量

1%--

9试剂和材料

,,。

除非另有说明本方法所用试剂均为分析纯实验用水为GB6682规定的一级水

9.1试剂

():。

9.1.1甲醇CHOH色谱纯

3

():。

9.1.2乙腈CHCN色谱纯

3

():。

9.1.3甲酸HCOOH色谱纯

():。

9.1.4冰乙酸CHCOOH优级纯

3

():。

9.1.5乙酸铵CHCOONH色谱纯

34

十二水合磷酸氢二钠(·)。

9.1.6NaHPO12HO

242

二水合磷酸二氢钠(·)。

9.1.7NaHPO2HO

242

氯化钠()。

9.1.8NaCl

氢氧化钠()。

9.1.9NaOH

9.2试剂配制

():。

乙酸甲醇溶液将冰乙酸和甲醇按比的体积比混合均匀

9.2.1-1+99199

():。

乙酸甲醇溶液将冰乙酸和甲醇按比的体积比混合均匀

9.2.2-2+98298

():,。

甲酸溶液将甲酸加入到水中混匀

9.2.31+9991mL999mL

/:,。

含乙酸铵的甲酸溶液称取乙酸铵加入甲酸溶液定容至

9.2.45mmolL0.1%0.19g0.1%500mL

()():()。

甲酸溶液乙腈溶液甲酸溶液与乙腈等体积混合均匀

9.2.50.1%-1+10.1%

():、、

9.2.6磷酸盐缓冲溶液PBS溶液称取十二水合磷酸氢二钠6.45g二水合磷酸二氢钠1.09g氯化

,。

钠4.25g用水溶解并定容至500mL

(/):,。

9.2.7氢氧化钠溶液1molL准确称取20.0g氢氧化钠用水溶解并定容至500mL

9.3标准品

(,:),,

河豚毒素号纯度或经国家认证并授予标准物质证书的标

CHNOCAS4368-28-9≥98%

111738

准物质。

9.4标准溶液配制

(/):(),

9.4.1河豚毒素标准储备液100mL准确称取河豚毒素标准品10m精确至0.1m用少量甲

μggg

(),,。

酸溶液0.1%溶解以甲醇定容至100mL-18℃以下避光保存

(/):(/),

9.4.2河豚毒素标准中间液1mL准确量取河豚毒素标准储备液100mL适量以甲酸溶液

μgμg

()(),/,。

乙腈溶液稀释并定容配制成的标准中间液以下避光保存

0.1%-1+11mL-18℃

μg

:(/),()

9.4.3河豚毒素标准系列工作液准确吸取河豚毒素标准中间液1mL适量以甲酸溶液0.1%-

μg

4

—

GB5009.2062016

(),//,。

乙腈溶液1+1稀释并定容得到浓度为1L~1000L的标准系列工作液现用现配

μgμg

9.5材料

:,,。

9.5.1河豚毒素免疫亲和柱柱规格3mL最大柱容量1000ng或等效柱

9.5.20.22m有机相微孔滤膜。

μ

10仪器和设备

:。

液相色谱串联质谱仪配电喷雾离子源

10.1-

:。

10.2分析天平感量为0.1mg和0.01g

均质机:/。

10.3≥12000rmin

10.4涡旋振荡器。

:/。

10.5高速冷冻离心机转速≥8000rmin

10.6固相萃取装置。

10.7氮吹仪。

11分析步骤

:,。、(/)

注为避免毒素的危害应戴手套进行操作移液器吸头等用过的器材废弃的提取液等应在氢氧化钠溶液1molL

,。

中浸泡1h以上以使毒素分解

11.1试样制备

,、、

用水清洗鱼体表面的污物滤纸吸干鱼体表面的水分后用剪刀将鱼体分解成肌