GB 5009.198-2016 食品安全国家标准 贝类中失忆性贝类毒素的测定

中华人民共和国国家标准

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GB5009.1982016

食品安全国家标准

贝类中失忆性贝类毒素的测定

2016-12-23发布2017-06-23实施

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会

发布

国家食品药品监督管理总局

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GB5009.1982016

前言

本标准代替/—《贝类记忆丧失性贝类毒素软骨藻酸的测定》、/—

GBT5009.1982003SNT1070

《进出口贝类中记忆丧失性贝类毒素检验方法》、/—《进出口贝类中软骨藻酸的检测

2002SNT18672007

方法液相色谱串联质谱法》、/—《贝类中失忆性贝类毒素检验方法酶联免疫吸附

-SNT26632010

法》。

/—,:

本标准与GBT5009.1982003相比主要变化如下

———“”;

标准名称修改为食品安全国家标准贝类中失忆性贝类毒素的测定

———修改了固相萃取条件;

———改变了流动相;

———增加了酶联免疫吸附法;

———增加了液相色谱串联质谱法。

-

Ⅰ

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GB5009.1982016

食品安全国家标准

贝类中失忆性贝类毒素的测定

1范围

、

本标准规定了贝类中失忆性贝类毒素测定的酶联免疫吸附法液相色谱法和液相色谱串联质

-

谱法。

,

本标准中酶联免疫吸附法适用于贝类及其制品中失忆性贝类毒素的测定液相色谱法和液相色谱-

()()。

串联质谱法适用于贝类及其制品不包括盐渍制品中失忆性贝类毒素软骨藻酸DA的测定

酶联免疫吸附法

2原理

,,

本方法测定基础是竞争性酶联免疫反应酶标板上包被有针对软骨藻酸抗体的捕捉抗体加入抗软

、,

骨藻酸抗体标准液或样品溶液及软骨藻酸酶标记物游离的失忆性贝类毒素与软骨藻酸酶标记物竞争

,。。

软骨藻酸抗体同时软骨藻酸抗体与捕捉抗体连接没有结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去将酶

。。

基质和显色剂加入到微孔中并且孵育结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物加入反应

。,

终止液后使颜色由蓝转变为黄色在450nm测量微孔溶液的吸光度值试样中失忆性贝类毒素的含

,。

量与吸光度值成反比按绘制的标准曲线定量计算

3试剂和材料

,,/。

除非另有说明本方法所用试剂均为分析纯水为GBT6682规定的一级水

3.1试剂

甲醇()。

3.1.1CHOH

3

十二水合磷酸氢二钠(·)。

3.1.2NaHPO12HO

242

氯化钠()。

3.1.3NaCl

氯化钾()。

3.1.4KCl

磷酸二氢钾()。

3.1.5KHPO

24

吐温()。

3.1.6-20CHO

5811426

抗抗体。

3.1.7DA

牛血清白蛋白()。

3.1.8BSA

3.1.9DA酶标记物。

3.1.10过氧化氢(HO)。

22

,,,四甲基联苯胺(,)。

3.1.113355-TMBCHN

16202

3.1.12硫酸(HSO)。

24

1

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GB5009.1982016

3.2试剂配制

():、、、

3.2.1PBS溶液pH7.4分别称取磷酸二氢钾0.20g十二水合磷酸氢二钠2.90g氯化钠8.00g氯

,。

化钾0.20g加水溶解并定容至1000mL

:,()。

抗体稀释液称取加溶液溶解并定容至

3.2.21.0BSAPBSH7.41000mL

gp

:。

抗抗体工作液抗抗体用抗体稀释液稀释至工作浓度

3.2.3DADA

:。

3.2.4DA酶标记物工作液用抗体稀释液将DA酶标记物稀释至工作浓度

:,()。

洗脱液吸取吐温用溶液稀释至

3.2.50.5mL-20PBSpH7.41000mL

(/):,,。

3.2.6硫酸溶液6molL吸取319.2mL硫酸缓缓加至600mL水中并用水稀释至1000mL

3.3标准品

软骨藻酸(,,号)标准溶液。

DACHNOCAS14277-97-5

15216

3.4标准溶液配制

:,

DA标准系列工作液准确吸取适量DA标准溶液用PBS溶液稀释并定容配制成质量浓度分别为

/、/、/、/、//。

和的标准系列工作液现

0nmL0.5nmL1.0nmL2.0nmL5.0nmL10.0nmLDA

gggggg

用现配。

3.5材料

3.5.1包被有DA捕捉抗体的微孔板。

:,。

注商业化试剂盒若评价技术参数达到本标准的要求则也适合于本标准参见附录A

水相微孔滤膜:。

3.5.20.45m

μ

4仪器和设备

4.1酶标仪。

:。

4.2天平感量为0.01g

4.3均质器。

:/。

4.4离心机转速≥6000rmin

5分析步骤

5.1样品采集

,。,

至少采集个贝类样品并使贝肉达以上冷冻样品置于保温盒中冷冻送检或保证其处

10200g

()。,,。

于低温状态0℃~10℃送检如为带壳样品应开壳去除水分后冷冻送检

5.2试样制备

5.2.1生鲜带壳样品

,,,。

用清水将贝类样品外表彻底洗净切断闭壳肌开壳用水淋洗内部去除泥沙及其他外来物将闭

,,。。

壳肌和连接在胶合部的组织分开取出贝肉切勿割破肉体开壳前不要加热或用麻醉剂收集100g

,,,,。

贝肉置于孔径约2mm的金属筛网上沥水5min检出碎壳等杂物将贝肉均质备用

2

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GB5009.1982016

5.2.2冷冻样品

,。,、、,

在室温下使冷冻样品呈半冷冻状态带壳冷冻样品按5.2.1方法清洗开壳淋洗取肉除去贝

,,。,。

肉外部附着的冰片抹去水分室温缓化将100g解冻的贝肉均质备用

5.2.3贝类罐头

,,。

将贝类罐头内容物沥干水分充分均质备用

5.2.4贝肉干制品

(),、、。

称取100g贝肉干制品放入一定量水中浸泡24h~48h4℃冷藏沥干均质备用

5.2.5盐渍制品

,,,,。

用清水洗涤流水脱盐沥干均质备用

5.3试样提取

(),,,,,

称取10g精确至0.01g试样加入10mL水涡旋振荡1min加入20mL甲醇涡旋振荡1min

/,,,,

6000rmin离心10min移取上清液用0.45m的水相微孔滤膜过滤得到试样提取液用PBS溶液

μ

(),。。

pH7.4稀释100倍得到试样稀释液吸取50L试样稀释液进行测定

μ

5.4测定

,、,

将已包被捕捉抗体的微孔条插入微孔架并做好标记其中包括空白对照孔标准液孔和样液孔分

。(),

别做平行孔向空白对照孔加入150LPBS溶液pH7.4向标准液孔加入50L失忆性贝类毒素标

μμ

,。,

准系列工作液向样液孔加入50L样液向上述所有微孔中加入100LDA酶标记物工作液轻轻混

μμ

,,,,

合再加入100LDA抗体工作液迅速充分混合1min用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发4℃孵育

μ

。,,,,,

2h孵育结束后倒去孔中液体每个微孔注入300L洗脱液冲洗翻转微孔板倾去孔内液体再重

μ

,。,

复以上洗板操作次在吸水纸上拍干每孔加过氧化氢和充分混合室温避光孵育

2150LTMB

μ

。(/),,

30min每孔加入50L硫酸溶液6molL迅速混匀终止反应在30min内